ELEKTROFORESIS

Prinsip
Pemisahan makromelekul berdasarkan perbedaan
laju (mobilitas) partikel bermuatan (total muatan,
ukuran dan bentuk) yg bergerak di bawah
pengaruh medan listrik
 Pemberian voltase (potensial listrik)
 Anoda dan katoda
Fasa diam: Kertas , Gel, Kapiler
Fasa gerak: makromolekul yg akan dipisahkan
(larutan/suspensi)
Pori memungkinkan molekul besar tertahan lebih
kuat daripada molekul kecil
Skema Elektroforesis
Proses
Bila molekul
bermuatan
ditempatkan
pada medan
listrik,
molekul-
molelkul
akan
bermigrasi ke
arah area
dengan beda
muatan
Teknik
1. Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
CGE dilakukan dalam matriks gel polimer berpori
yang mengandung campuran buffer
2. Capillary Isotachophoresis (CITP)
seluruh pita analit bermigrasi pada kecepatan yang
sama
Dalam beberapa aplikasi khusus, baik kation
atau anion dapat terpisah, tapi keduanya
tidak pada waktu yang bersamaan.
3. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
CIEF digunakan untuk pemisahan spesies
amphiprotic, seperti asam amino dan protein
yang mengandung gugus asam amino dan
gugus amina basa lemah
Factor Affecting
Muatan listrik ion yg akan dipisahkan
Konsentrasi gel (let’s see beside)
Ukuran partikel
Higher concentrations
of agarose facilite
separation of small
DNAs

Low agarose
concentrations allow
resolution of larger
DNAs
Factor Affecting
Medium
secara ideal:
berfungsi sebagai media migrasi elektron atau
penyaringan berdasarkan ukuran molekul
bahan kimia inert,
mudah ditangani ,
daya serap yang baik
Temperatur
temperatur lebih tinggi mempercepat proses migrasi
Factor Affecting
Tegangan yang digunakan
Pada tegangan 100-500 V, kecepatan migrasi
molekul sebanding dengan tinggi tegangan.
Tegangan 500-10000 V, mobolitas molekul
meningkat drastis, untuk memisahkan senyawa
dengan BM rendah
Capillary Electrophoresis Process
Commonly Gel used
Agarose
acrylamide gels

Efek neurotoksik: Monomer

dapat mencemari makanan
dengan efek toksin saraf
Detection System
 Deteksi:
 UV/Fluorescence
 Mass Spectrometry
Pemanfaatan
 Analisis dan pemurnian molekul besar
 Proteins, nucleic acids
 Analisis molekul bermuatan lebih
sederhana
 gula, asam amino, nukleotida, simpler
ion
Cut and paste: pengambilan sepenggal
DNA (a gene) suatu organisme (untuk
digabungkan dengan DNA organisme
lain—kajian kerja gen)
Modifikasi sifat organisme berdasarkan
pencangkokan gen
How does electrophoresis work?
• Gel agarosa 1 % tak bermuatan listrik
• DNA bermuatan (negative molecules)
• Molekul terpisah dengan mekanisme
penyortiran, berdasar
• Charge
• Size
• Shape
Cut and Paste:
How does it work?
•DNA dipotong menjadi fragmen yang lebih
kecil.
•Pemuatan pewarna digunakan untuk
menunjukkan fragmen DNA berada di
belakang pewarna
•Molekul DNA negatif tertarik ke elektroda
positif.
•Fragmen terkecil bergerak dengan jarak
Aplikasi khusus:
Teknik RFLP Uji DNA
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
 Ekstraksi sekuens DNA sel jaringan
 Untaian DNA hasil ekstraksi dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi.
 Potongan DNA ini diproses pada gel agarose dengan menggunakan
teknik elektroforesis untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan
berat molekulnya dengan menggunakan arus listrik.
 Gel hasil elektroforesis selanjutnya ditransfer ke membran nilon
dengan menggunakan teknik bloting.
 Selanjutnya radioaktif probe ditambahkan untuk menggandeng
potongan DNA yang sesuai dan memindahkannya ke membran nilon.
 Pemotretan membran (membubuhkan bahan pewarna atau unsur
radioaktif) pola garis-garis sidik jari DNA yang terbentuk dapat
divisualisasikan dan dianalisis kecocokannya
Gel agarose dan membran poliakrilamid
Poliakrilamid
CH2=CHCONH2 + CH2(NHCOHC=CH2)2
Acrylamide N,N,N,N-methylenebisacrylamide
Free radical catalyst
-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-
CO CO CO
NH NH2 NH
CH2 n CH2
NH NH
CO NH2
CO
CO
-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-
n
Molecular Mass Determination
 Data berikut
merupakan jarak
pergerakan molekul-
molekul pada
Distance
elektroforesis dengan Mr moved
media SDS-akrilamida. (mm)
Suatu protein baru, X Transferin 78000 2
dikembangkan dan Bovin serum albumin 66000 14
Ovalbumin 45000 40
dianalisis dengan
Glyceraldehyde-3-phophate dehyd. 36000 48
prosedur serupa, Carbonic anhydrase 29000 55
tampak memiliki jarak Trypsinogen 24000 63
pergerakan molekul 45 Soyabean Tripsin inh 20100 68
mm pada media. Myoglobin 18400 68
B-Lactoglobulin 17800 70
Tentukan kisaran massa Lysozime 14300 75
molekul protein X. Cytochrome C 12400 78