Pemisahan secara

Elektroforesis
Apt. Andre Prayoga, M.Farm
Prinsip
Pemisahan makromelekul berdasarkan perbedaan
laju (mobilitas) partikel bermuatan (total muatan,
ukuran dan bentuk) yg bergerak di bawah
pengaruh medan listrik
 Pemberian voltase (potensial listrik)
 Anoda dan katoda
Fasa diam: Kertas , Gel, Kapiler
Fasa gerak: makromolekul yg akan dipisahkan
(larutan/suspensi)
Pori memungkinkan molekul besar tertahan lebih
kuat daripada molekul kecil
Scheme
Proses
Bila molekul
bermuatan
ditempatkan
pada medan
listrik,
molekul-
molelkul
akan
bermigrasi ke
arah area
dengan beda
muatan
Teknik
1. Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
CGE dilakukan dalam matriks gel polimer berpori
yang mengandung campuran buffer
2. Capillary Isotachophoresis (CITP)
seluruh pita analit bermigrasi pada kecepatan yang
sama
Dalam beberapa aplikasi khusus, baik kation
atau anion dapat terpisah, tapi keduanya tidak
pada waktu yang bersamaan.
3. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
CIEF digunakan untuk pemisahan spesies
amphiprotic, seperti asam amino dan protein
yang mengandung gugus asam amino dan
gugus amina basa lemah
Factor Affecting
Muatan listrik ion yg akan dipisahkan
Konsentrasi gel (let’s see beside)
Ukuran partikel
Higher concentrations
of agarose facilite
separation of small
DNAs

Low agarose
concentrations allow
resolution of larger
DNAs
Factor Affecting
Medium
secara ideal:
berfungsi sebagai media migrasi elektron atau
penyaringan berdasarkan ukuran molekul
bahan kimia inert,
mudah ditangani ,
daya serap yang baik
Temperatur
temperatur lebih tinggi mempercepat proses migrasi
Factor Affecting
Tegangan yang digunakan
Pada tegangan 100-500 V, kecepatan migrasi
molekul sebanding dengan tinggi tegangan.
Tegangan 500-10000 V, mobolitas molekul
meningkat drastis, untuk memisahkan senyawa
dengan BM rendah
Capillary Electrophoresis Process
Commonly Gel used
Agarose
acrylamide gels

Note:
Neurotoxic effect: The
monomer may contaminate
food with the nerve toxin
effect
Detection System
 Deteksi:
 UV/Fluorescence
 Mass Spectrometry
Pemanfaatan
 Analisis dan pemurnian molekul besar use of
restriction
 Proteins, nucleic acids enzymes
 Analisis molekul bermuatan lebih isolated
from
sederhana bacteria as
 gula, asam amino, nukleotida, simpler natural
ion defense
mechanism
Cut and paste: pengambilan sepenggal to cut up
DNA (a gene) suatu organisme (untuk the
invading
digabungkan dengan DNA organisme DNA of
lain—kajian kerja gen) bacteriopha
ges – viruses
Modifikasi sifat organisme berdasarkan that infect
pencangkokan gen bacteria
How does electrophoresis work?
• Gel agarosa 1 % tak bermuatan listrik
• DNA bermuatan (negative molecules)
• Molekul terpisah dengan mekanisme
penyortiran, berdasar
• Charge
• Size
• Shape
Cut and Paste:
How does it work?
• DNA is cut into smaller fragments.
• Loading dye is used to indicate the
fragments of DNA are behind the dye
• The negative DNA molecule is attracted to
the positive electrode.
• The smallest fragments move the greatest
distance.
Aplikasi khusus:
Teknik RFLP Uji DNA
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

 Ekstraksi sekuens DNA sel jaringan

 Untaian DNA hasil ekstraksi dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi.  
 Potongan DNA ini diproses pada gel agarose dengan menggunakan
teknik elektroforesis untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan
berat molekulnya dengan menggunakan arus listrik. 
 Gel hasil elektroforesis selanjutnya ditransfer ke membran nilon
dengan menggunakan teknik  bloting. 
 Selanjutnya radioaktif probe ditambahkan untuk menggandeng
potongan DNA yang  sesuai  dan memindahkannya ke membran nilon.
 Pemotretan membran (membubuhkan bahan pewarna atau unsur
radioaktif) pola garis-garis sidik jari DNA yang terbentuk dapat
divisualisasikan dan dianalisis kecocokannya
Gel agarose dan membran poliakrilamid
Molecular Mass Determination
 Data berikut
merupakan jarak
pergerakan molekul-
molekul pada
Distance
elektroforesis dengan Mr moved
media SDS-akrilamida. (mm)
Suatu protein baru, X Transferin 78000 2
dikembangkan dan Bovin serum albumin 66000 14
Ovalbumin 45000 40
dianalisis dengan
Glyceraldehyde-3-phophate dehyd. 36000 48
prosedur serupa, Carbonic anhydrase 29000 55
tampak memiliki jarak Trypsinogen 24000 63
pergerakan molekul 45 Soyabean Tripsin inh 20100 68
mm pada media. Myoglobin 18400 68
B-Lactoglobulin 17800 70
Tentukan kisaran massa Lysozime 14300 75
molekul protein X. Cytochrome C 12400 78
Analisis data
Untuk data di atas, maka analisis dilakukan dengan
metode grafik standar.
 Buatlah grafik log Mr vs jarak perpindahan.
 Tentukan Mr protein X dengan intrapolasi grafik
 Catatan: metode ini memiliki akurasi ± 10 %, sehingga Mr
tentukan dalam jumlah terkoreksi akurasi tersebut.

Hint:
crosscheck, bahwa jawaban atas hal di atas adalah
Mr = 41.342,73 ± 4,13
Terimakasih