Nama: Muhamad Rizqi PJP : Prof. Dr. dr.

Sri Budiarti
NIM: E2401211060 Asisten Praktikum:
Paralel: ST13.1 1. Muhammad Aby PR. (G34180057)
Hari, Tanggal: Senin, 18 Oktober 2021 2. Aas Ratnasari (G34180104)
3. Aditya Prima F. (E34190065)
4. Paulina Ratualisa S. (G84190031)

ISOLASI DNA, ELEKTROFORESIS GEL, DAN POLYMERASE

CHAIN REACTION

LATAR BELAKANG
Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya seperti
lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Isolasi DNA berguna untuk beberapa analisis
molekuler dan rekayasa genetika. Metode isolasi DNA yang bisa digunakan sangat banyak,
akan tetapi tahapan isolasi DNA pada semua bahan dan semua metode itu sama, yakni lisis
sel atau jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleoprotein, dan inaktivasi nuklease
(Hariyadi et al. 2018). Isolasi DNA dapat dilakukan pada semua makhluk hidup dan juga
virus. Salah satu tantangan dalam isolasi DNA yakni isolasi DNA pada organisme hewan
mamalia. Mamalia memiliki kompleksifitas jaringan dan organ yang sangat tinggi, sehingga
ditemukan berbagai macam kendala dalam proses pengerjaan isolasi DNA pada hewan
mamalia seperti terlalu banyaknya lipid dan protein yang menyusun suatu jaringan, dan
adanya enzim nuklease pada beberapa organ hewan yang juga dapat merusak asam nukleat
(Cseke et al. 2012).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya,
dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung
sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik
yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian
dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif melalui membran matriks
gel agarose positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan
terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono 2006).

Suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro disebut Polymerase Chain
Reaction (PCR). Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam
jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Komponen yang diperlukan pada proses PCR
yakni templat DNA, kemudian sepasang primer suatu oligonukleotida yang komplementer
dengan urutan nukleotida DNA templat, lalu dNTPs (Deoxynucleotide triphospate), buffer
PCR, magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA (Handoyo dan Rudiretna
2001).
 TUJUAN
Praktikum ini bertujuan mempelajari teknik isolasi DNA untuk mendapatkan DNA yang
dapat digunakan sebagai template PCR, Mempelajari teknik elektroforesis gel agarose untuk
memisahkan fragmen DNA, dan mempelajari teknik amplifikasi DNA dengan Polymerase
Chain Reaction.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA

1. Apa fungsi dari buffer lisis?

Jawaban : Buffer lisis berperan untuk memecahkan membran sel inang untuk mengeluarkan
DNA genom dan menentukan konsentrasi DNA yang dihasilkan (Mulyani et al. 2011).

2. Mengapa campuran buffer lisis dan sampel perlu diinkubasi pada suhu tertentu?
Jawaban : Karena digunakan untuk mengatur kestabilan dalam pemisahan jaringan dan
membrane sel untuk mendapatkan gen DNA, karena jika suhu inkubasi yang digunakan
terlalu tinggi maka dapat merusak DNA, sedangkan jika suhu terlalu rendah maka membran
serta jaringan sel tidak dapat hancur. (Langga et al. 2012).

3. Apa fungsi sentrifugasi dalam percobaan ini?

Jawaban : Sentrifugasi salah satu teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian
bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi
akan menunjukan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan
pelet pada bagian bawah (Karp 2008).

4. Apa fungsi ethanol dingin?

Jawaban : Larutan yang berisi DNA akan ditambah ethanol absolut dingin untuk
mengendapkan DNA yang akan tampak sebagai benang-benang halus berwarna putih
(Yulianti 2006).

5. Pada tahapan setelah pemberian ethanol dingin dan disentrifugasi, di bagian mana DNA
berada?
Jawaban : Setelah tahapan pemberian etanol dingin dan disentrifugasi, DNA terletak pada
bagian dasar tabung yang digunakan pada proses supernatant DNA yang dimana DNA yang
terpisah dari cairan supernatant dan terletak pada DNA pelet.

Elektroforesis

1. Apa yang anda ketahui tentang gel agarose?

Jawaban : Gel agarosa salah satu medium yang digunakan dalam menggunakan
elektroforesis. Gel agarosa salah satu metode standar untuk mengidentifikasi serta
memurnikan fragmen-fragmen Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) dan Ribose Nucleic Acid
(RNA). Senyawa tersebut merupakan pembawa genetika pada makhluk hidup yang dilakukan
pada medan listrik horizontal. Kelebihan dari gel ini lebih mudah, sederhana dan laju
pemisahannya lebih cepat membentuk fragmen-fragmen dan tidak bersifat toksik. Namun
kelemahannya gel ini memiliki sensitifitas tinggi dan mudah rusak sehingga memerlukan
ketelitian dan kehati-hatian pada proses pengerjaannya (Harahap 2018).

2. Apa fungsi larutan buffer pada teknik elektroforesis gel agarose?

Jawaban : Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium pemisah
dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik
(Harahap 2018).

3. Mengapa sampel DNA harus diletakkan pada sisi negatif?

Jawaban : DNA bermuatan negatif karena kehadiran grup fosfat sebagai penyusunnya.
Dengan hal ini, DNA harus diletakkan pada sisi anoda agar mengalami pergerakan ke sisi
katoda.

4. Apa tujuan memberikan arus listrik pada elekroforesis gel agarose?

Jawaban : Pemisahan fragmen DNA pada elektroforesis menggunakan arus listrik di
permukaan gel agarosa bertujuan untuk memisahkan molekul DNA, RNA, dan molekul
protein. Arus listrik juga berfungsi untuk memberi muatan pada protein untuk bergerak
melewati pori gel dan bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel
protein (Aslinda dan Ahmad 2016).
5. Apa yang menyebabkan fragmen DNA dapat terpisah satu sama lain pada gel agarose?

Jawaban : Fragmen DNA dapat terpisah dengan satu sama lain disebabkan oleh adanya
perbedaan kecepatan fragmen yang berbeda ukuran ketika bergerak melalui pori-pori gel
agarosa. Ukuran molekul yang lebih besar menyebabkan perpindahan molekul menurun dan
membutuhkan energi perpindahan yang cukup besar dibanding molekul lain yang memiliki
ukuran yang lebih kecil (Harahap 2018).
6. Mengapa fragmen DNA yang berukuran lebih besar akan berada dekat dengan kutub
negatif?
Jawaban : DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuranmolekul
DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Molekul
DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara
umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul
kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk
fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara
ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat
mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi
pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tabel 1 Konsentrasi DNA hasil PCR

Waktu Kombinasi Suhu Annealing dan Siklus PCR
o
Denaturatio 45 C 56 oC 68 oC
N n, Ulan
o Annealing, gan
15 25 35 15 25 35 15 25 35
Extension
(sec)
1 10, 10, 20 1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Rata-rata 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 30, 30, 60 1 19.3 60.5 93.9 51.6 99.6 86 1.2 8.2 19
111
2 21.3 62.5 79.1 43.2 87.9 1.2 6.8 20.3
3 17.1 65.2 81.6 42.9 86.2 94.9 1.3 7.1 10.3
Rata-rata 19.2 62.73 84.86 45.9 91.23 97.3 1.23 7.36 16.5
3 3

Berdasarkan tabel tersebut memperlihatkan bahwa proses hasil PCR suhu annealing
o
56 C menjadi suhu optimal pada percobaan kali ini, waktu yang lebih lama pun berpengaruh
kepada hasil, bersamaan dengan semakin banyak siklus maka semakin besar juga hasil yang
diperoleh.

1. Fenomena sel mana yang ditiru oleh Teknik PCR?

Jawaban : Fenomena sel yang ditiru oleh teknik PCR yaitu proses replikasi DNA secara in
vivo yang bersifat semi konservatif. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara
dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in
vivo).

2. Utas DNA mana dari template DNA yang diamplifikasi?

Jawaban : DNA target dari template DNA menggunakan DNA polimerase yang akan
diamplifikasi. Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan
(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan
molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan
sepasang primer oligonukleotida.

3. Apa fungsi primer?

Jawaban : Primer berfungsi menentukan produk DNA yang akan direplikasi. Primer menjadi
pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan menyediakan gugus hidroksi (-
OH) pada ujung 3’ yang diperlukan proses eksistensi DNA.

4. Apa fungsi enzim DNA polimerase?

Jawaban : Enzim DNA polimerase berfungsi menghubungkan nukleotida-nukleotida yang
masih terpisah agar menyatu untuk membentuk produk PCR. Nukleotida yang dihubungkan
terdapat empat jenis basa, yaitu adenin, timin, sitosinin, serta guanin.

5. Pada suhu berapa utas DNA bisa terpisah, dan pada suhu berapa utas DNA bisa disintesis?
Jawaban : Utas DNA terpisah pada proses denaturasi yang membutuhkan suhu 94°C,
sedangkan sintesis utas DNA terjadi pada proses ekstensi primer yang dilakukan pada suhu
72°C.

6. Berapa molekul DNA yang terbentuk dari satu molekul DNA yang diamplifikasi dengan
PCR setelah 35 siklus
Jawaban : Banyak molekul DNA yang terbentuk setelah melakukan amplifikasi dengan PCR
sebanyak 35 siklus sebanyak 6,6 μL.

7. Apa fungsi perubahan suhu pada proses PCR ini?

Jawaban : pada proses denaturasi, dua utas DNA dipisahkan secara fisik dengan suhu tinggi
dan kemudian pada proses selanjutnya yaitu annealing suhu diturunkan untuk memfasilitasi
penempelan DNA polymerase secara spesifik pada untas tunggal DNA yang sudah
berkomplementasi dengan primer.

8. Pada suhu denaturasi berapa tidak terbentuk produk PCR? Mengapa?

Jawaban : Pada suhu denaturasi 50°C tidak ada produk PCR yang terbentuk disebabkan oleh
aktivitas enzim polimerasi DNA. Enzim polimerase yang digunakan pada tahap denaturasi
diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik yang aktif pada temperatur 95°C.
Beberapa contoh enzim tersebut adalah enzim Pfupolimerase yang diisolasi dari bakteri
Pyrococcus furiosus dan enzim Taq polimerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA serta dapat
merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses
denaturasi DNA templat tidak sempurna. Umumnya, suhu denaturasi yang digunakan adalah
94oC (Handoyo dan Rudiretna 2001).

9. Faktor apa saja yang mempengaruhi keberhasilan PCR?

Jawaban : Keberhasilan PCR dapat tercapai apabila pada prosesnya dilakukan optimasi PCR.
Hasil PCR yang optimal dapat ditentukan oleh beberapa faktor seperti primer, jenis
polimerase DNA, suhu, konsentrasi, buffer PCR, serta waktu.

10. Kondisi PCR seperti apa dari simulasi yang anda kerjakan yang menghasilkan produk
paling optimum?
Jawaban : Pada dasarnya, hasil PCR yang optimal bisa didapat dengan mengoptimalkan
prosesnya. Optimalisasi tersebut dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang
digunakan pada PCR tersebut, seperti jenis Polimerase DNA, suhu, konsentrasi, larutan
buffer, dan waktu.

SIMPULAN

Teknik Isolasi DNA menggunakan prinsip memecah dan mengekstraksi jaringan

sehingga terbentuk template DNA. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan
fragmen DNA berdasarkan ukuran fragmen dengan bantuan gel agarose. Teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) memiliki tiga tahapan yaitu: denaturation (pemisahan utas DNA),
annealing (penempelan primeroligonukleotida pada bagian DNA sekuen homolognya) dan
extension (pembentukan utas DNA baru berdasarkan template DNA dari setiap utas).

DAFTAR PUSTAKA

Aslinda, W., Ahmad, A. 2016. Isolasi dan karakterisasi agarosa dari makroalga merah
Euchema cottoni untuk pemisahan fragmen DNA. Online Journal of Natural Science.
5(3):307-317.
Cseke, Leland J., Joseph R. H. 2012. Laboratory Methods in Cell Biology. USA (US):
Academic Press.
Handoyo, D., Rudiretna, A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Unitas. 9(1):17-29.

Harahap, M.R., 2018. Elektroforesis: Analisis elektronika terhadap biokimia

genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1).
Hariyadi, S., Narulita, E., Rais, M. A. 2018. Perbandingan metode lisis jaringan hewan dalam
proses isolasi DNA genom pada organ liver tikus putih (Rattus norvegicus). Biology
Education Conference. 15(1):689–692.
Karp, G. 2008. Cell and Molecular Biology. Michigan (US): Willey.

Langga, I.F., Restu, M. and Kuswinanti, T., 2012. Optimalisasi suhu dan lama inkubasi
dalam ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta analisis keragaman
genetik dengan teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi, 12(3), 265-276.
Mulyani, Y., Purwanto, A. and Nurruhwati, I., 2011. Perbandingan beberapa metode isolasi
DNA untuk deteksi dini koi herpes virus (KHV) pada ikan mas (Cyprinus carpio
L.). Jurnal Akuatika, 2(1).
Yulianti, E. 2006. Pengembangan teknik isolasi DNA tumbuhan menggunakan detergen
komersial. Seminar Nasional MIPA. ).[diakses 24 Okt 2021]. doi:
http://eprints.uny.ac.id/id/eprint/11869
Yuwono T. 2006. Teori Dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Penerbit
ANDI.