Nama : Rachmalia Isni Oktaviani PJP : Dr. Ir.

Nampiah
NIM : I1401211023 Asisten :
Kelas/Kel : ST12.2/09 1. Qurrotu Ayni (G34170025)
Hari/Tanggal : Jumat, 22 Oktober 2021 2. Shalmy Nurma M. (F24180052)
3. Sopha Erna A. (E14190038)
4. Hasna Haniyah S (G34190019)

ISOLASI DNA, ELEKTROFORESIS GEL, DAN POLYMERASE CHAIN REACTION

Tujuan
1. Mempelajari teknik isolasi DNA untuk mendapatkan DNA yang dapat digunakan sebagai
template PCR
2. Mempelajari teknik elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan fragmen DNA
3. Mempelajari teknik amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction

Latar Belakang
Isolasi DNA adalah tahap dasar dari pembelajaran biologi molekuler. DNA bisa diisolasi
dari beragam sampel, mulai dari cairan tubuh, bercak darah kering, sidik jari, tanah, hingga
organisme renik, hewan, dan tumbuhan. Ada tiga tahapan penting dalam isolasi DNA, yaitu lisis
dinding sel, pemisahan DNA dari organel sel, dan pemurnian DNA (Rachmawati dan Khoiriyah
2018; Shetty dan Dairawan 2020). Adapun elektroforesis gel agarosa berperan sebagai saringan
molekular yang memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran, muatan listrik, dan ciri fisik
lainnya (Urry et al. 2016). Terakhir, PCR adalah metode molekuler untuk mereplikasi fragmen
DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat. Penggandaan tersebut dilakukan
dengan menggunakan enzim dan sepasang primer yang bersifat spesifik terhadap DNA target.
Nantinya, hasil replikasi dapat digunakan untuk keperluan lain yang berkaitan dengan DNA
(Joko et al. 2011).

Hasil dan Pembahasan

Isolasi DNA
1. Simak Video Teknik Isolasi DNA Bagian I https://www.youtube.com/watch?v=tcPgdR9_t64
dan Bagian II (https://www.youtube.com/watch?v=1PisbDHKXTU)
2. Jawablah pertanyaan di bawah ini:
a. Apa fungsi dari buffer lisis?
Jawab: Buffer lisis digunakan dalam proses penghancuran sel agar struktur DNA tetap
terjaga selama fase lisis dan purifikasi (Buwono et al. 2016). Dengan larutan buffer,
penghilangan protein dan RNA menjadi lebih mudah. Ditambah lagi, buffer mencegah
terjadinya aktivitas enzim pendegradasi DNA ataupun perubahan pada DNA (Nugroho
dan Rahayu 2018).

b. Mengapa campuran buffer lisis dan sampel perlu diinkubasi pada suhu tertentu?
Jawab: Inkubasi pada suhu tertentu dilakukan agar campuran buffer lisis dan sampel
menjadi homogen. Dengan demikian, buffer dapat menghancurkan sel sampel secara
optimal. Suhu inkubasi perlu diperhatikan karena suhu yang terlalu panas menyebabkan
kerusakan pada DNA dan memungkinkan terjadinya peristiwa osmosis selama inkubasi
(Mulyani et al. 2011).
 c. Apa fungsi sentrifugasi dalam percobaan ini?
Jawab: Sentrifugasi pada percobaan ini berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat-zat
yang tidak diperlukan. Sentrifugasi yang pertama memisahkan kotoran dari larutan yang
mengandung DNA. Kotoran yang mengendap di dasar tabung dibuang. Adapun DNA
yang terkandung di cairan supernatan dipindahkan ke tabung lain. Sentrifugasi yang
kedua dan ketiga memisahkan DNA dari larutan. Larutannya dibuang sehingga
menyisakan DNA yang mengendap di dasar tabung.

d. Apa fungsi ethanol dingin?

Jawab: Ethanol ditambahkan pada saat pencucian DNA bertujuan mengendapkan DNA
karena asam nukleat akan mengendap dan sukar larut dalam ethanol. Sebaliknya, zat-zat
pengotor akan larut dalam ethanol (Mulyani et al. 2011). Hal tersebut terjadi sebab
adanya perbedaan polaritas. Ethanol yang ditambahkan harus dingin agar DNA yang
mengendap lebih banyak (Rachmawati et al. 2013).

e. Pada tahapan setelah pemberian ethanol dingin dan disentrifugasi, di bagian mana DNA
berada?
Jawab: DNA mengendap di dasar tabung setelah diberikan ethanol dan disentrifugasi.

Elektroforesis Gel
1. Simak Video Teknik Elektroforesis Gel https://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ
2. Jawablah pertanyaan berikut:
a. Apa yang anda ketahui tentang gel agarosa?
Jawab: Gel agarosa berasal dari polisakarida agar yang diekstrasi dari rumput laut merah
(Rhodophycae). Polisakarida tersebut mengandung komponen ideal dan tidak bermuatan
yang dinamakan agarosa (Guanghui dan Zhiguo 2013). Pada elektroforesis gel agarosa
berperan sebagai media pemisah karena memiliki viskositas yang tinggi. Keunggulan
dari penggunaan medium gel agarosa adalah pemisahan fragmen-fragmennya
berlangsung cepat, lebih mudah, dan sederhana. Selain itu, medium ini tidak bersifat
toksik. Namun, gel ini sangat sensitif dan mudah rusak sehingga diperlukan kehati-
hatian dalam pengerjaannya (Harahap 2018).

b. Apa fungsi larutan buffer pada teknik elektroforesis gel agarosa?

Jawab: Larutan buffer berfungsi mempertahankan pH di dalam medium gel agarosa.
Ketepatan pH sangat penting diperhatikan agar fragmen DNA dapat dipisahkan tanpa
terjadinya modifikasi struktural. Secara lebih lanjut, larutan buffer juga berperan sebagai
penyuplai elektrolit pada saat elektroforesis berlangsung (Harahap 2018).

c. Mengapa sampel DNA harus diletakkan pada sisi negatif?

Jawab: DNA bermuatan negatif, sehingga DNA tentu diletakkan pada sisi negatif. DNA
tersebut akan bergerak dari elektroda negatif (katoda) melewati media gel menuju
elektroda positif (anoda).

d. Apa tujuan memberikan arus listrik pada elekroforesis gel agarosa?

Jawab: Pemberian arus listrik bertujuan untuk menguraikan fragmen-fragmen DNA.
Sampel DNA akan mulai berpindah akibat adanya aliran listrik.
 e. Apa yang menyebabkan fragmen DNA dapat terpisah satu sama lain pada gel agarosa?
Jawab: Penyebab terpisahnya fragmen-fragmen DNA adalah medan listrik yang
dihasilkan arus listrik. Pemisahan dengan elektroforesis berasas hukum Coulomb, yaitu
gaya pada salah satu titik muatan berbanding lurus dengan besar muatannya (Harahap
2018).

f. Mengapa fragmen DNA yang berukuran lebih kecil akan berada dekat dengan kutub
positif, sedangkan yang lebih besar akan berada ke arah negatif?
Jawab: Molekul yang ukurannya lebih besar membutuhkan energi perpindahan yang
lebih besar sehingga migrasinya lebih kecil dari molekul berukuran lebih kecil (Harahap
2018). Selain tu, fragmen yang berukuran kecil mendapat hambatan lebih sedikit dari
medium gel (Urry et al. 2016). Oleh sebab itu, fragmen yang berukuran lebih kecil
berada di dekat kutub positif karena bergerak lebih jauh.

Teknik Polymerase Chain Reaction

1. Simak Video Animasi PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo&frags=pl%2Cwn
2. Perhatikan tahapan dari PCR. Simak juga Video Deteksi GMO dengan PCR.
https://www.youtube.com/watch?v=liCG5aaEu9w
3. Lakukan simulasi PCR virtual dengan mengunjungi link http://virtual-pcr.ico2s.org/pcr/
dan pelajari petunjuk yang ada di gambar pada web tersebut
4. Lakukan modifikasi kondisi PCR dengan mengubah beberapa parameter pada bagian kiri
dari window sebagian berikut:
a. Jumlah Siklus: 15, 25, dan 35
b. Suhu Annealing: 45, 56, dan 68 C
c. Waktu Denaturasi, Annealing, dan Extention dengan kombinasi 10, 10, 20 dan 30, 30,
60 detik
5. Beberapa parameter yang tidak perlu diubah adalah:
a. Suhu Denaturasi: 94 C
b. Extension: 72 C
c. Plasmid: 100 ng
d. Each dNTP: 0.5 uL
e. Each primer: 1 uL
f. Polimerase: 1 uL
g. Jenis Polimerase: Taq
Tabel 1 Konsentrasi DNA Hasil PCR
Waktu Kombinasi Suhu Anneling, dan Siklus PCR
Denaturasi,
No Anneling, dan Ulangan 45 C 56 C 68 C
Extension
(Sec) 15 25 35 15 25 35 15 25 35
1. 10 10 20 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Rata-Rata 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2. 30, 30, 60 1 13,6 34,7 88,0 34,3 68,9 86,7 0,7 3,7 9,1
2 12,4 61,1 82,5 37,0 95,8 82,5 0,5 3,8 12,3
3 9,7 53,0 76,3 36,8 88,0 102,1 0,7 7,0 8,8
Rata-Rata 11,90 49,60 80,27 36,03 84,23 90,43 0,63 4,83 10,06

Jawablah pertanyaan berikut:

1. Fenomena sel mana yang ditiru oleh Teknik PCR?
Jawab: Fenomena sel yang dicontoh oleh teknik PCR adalah replikasi sel.

2. Utas DNA mana dari template DNA yang diamplifikasi?

Jawab: Utas DNA dari template DNA yang diamplifikasi memiliki bentuk replikatif. Utas
tersebut adalah DNA intermediet yang berbentuk sirkuler dan utas ganda (Santoso et al.
2015).

3. Apa fungsi primer?

Jawab: Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi
sekaligus sebagai penyedia gugus hidroksil (-OH) pada ujung 3’ yang dibutuhkan dalam
proses ekstensi DNA (Yustinadewi et al. 2018).

4. Apa fungsi enzim DNA polymerase?

Jawab: Enzim DNA polymerase berfungsi melakukan katalisis untuk reaksi polimerisasi
DNA (Joko et al. 2011). Enzim yang digunakan bersifat tahan terhadap temperatur tinggi.
Misalnya, enzim Taq DNA polimerase yang mampu bertahan sampai suhu mendidih 100ºC.
Aktivitas optimum enzim ini berlangsung pada suhu 92-95ºC (Feranisa 2016).

5. Pada suhu berapa utas DNA bisa terpisah, dan pada suhu berapa utas DNA bisa
disintesis?
Jawab: Utas DNA terpisah menjadi untai tunggal saat proses denaturasi. Proses ini
biasanya terjadi dalam kisaran suhu 90–95C. Sedangkan, pada tahap sintesis terjadi
pembentukan DNA berdasarkan informasi pada DNA template. Suhu pada tahap ini
biasanya berada dalam kisaran 70–75C (Joko et al. 2011)

6. Berapa molekul DNA yang terbentuk dari satu molekul DNA yang diamplifikasi dengan
PCR setelah 35 siklus?
Jawab : Setiap satu siklus yang berhasil dilakukan menghasilkan molekul DNA sebanyak
dua kali lipat dari jumlah semula. Artinya, banyaknya molekul DNA yang diamplifikasi
setelah n kali siklus setara dengan 2n (Urry et al. 2016). Jumlah molekul DNA yang
terbentuk setelah 35 siklus adalah 235 = 34.359.738.368 molekul.

7. Apa fungsi perubahan suhu pada proses PCR ini?

Jawab: Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,
annealing, dan ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Denaturasi memerlukan suhu
tinggi untuk memutus ikatan ganda DNA. Lalu, tahap annealing adalah tahap paling
penting dalam PCR. Kesalahan pada tahap ini akan mempengaruhi kemurnian pada hasil
akhir. Suhu annealing yang terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan primer
pada DNA template yang tidak spesifik. Namun, suhu yang terlalu tinggi membuat
 produk dihasilkan secara kurang efisien. Adapun pada tahap ekstensi, suhu dinaikkan
guna mengaktivasi enzim DNA polymerase untuk mensintesis DNA. Perubahan suhu
pada mesin PCR membuat tahapan-tahapan dalam siklus PCR berjalan sehingga
meghasilkan pertambahan fragmen-framen tertentu dari DNA template secara
eksponensial. (Usman 2016; Yustinadewi et al. 2018)

8. Pada suhu denaturasi berapa tidak terbentuk produk PCR? Mengapa?

Jawab: Denaturasi biasanya terjadi dalam kisaran suhu 90–95C (Joko et al. 2011).
Denaturasi yang tidak sempurna bisa memungkinkan terputusnya utas DNA. Selain itu,
denaturasi yang berlangsung terlalu lama dapat menyebabkan hilangnya aktivitas enzim
(Usman 2016).

9. Faktor apa saja yang mempengaruhi keberhasilan PCR?

Jawab: Faktor-faktor yang mempengaruhi tingkat keberhasilan PCR antara lain
deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP); oligonukleotida primer; DNA template;
komposisi larutan buffer; jumlah siklus reaksi; enzim yang digunakan; dan faktor teknis
dan non-teknis lainnya, seperti kontaminasi. Molekul DNA yang dihasilkan lewat metode
PCR berjumlah sangat banyak dalam waktu singkat. Oleh karena itu, jika terjadi
kontaminasi maka akan banyak mengacaukan hasil replikasi tersebut (Feranisa 2016).

10. Kondisi PCR seperti apa dari simulasi yang anda kerjakan yang menghasilkan produk
paling optimum?
Jawab : Simulasi PCR menghasilkan produk paling optimum sebesar 102,1 uL. Hal
tersebut dapat tercapai dengan memodifikasi kondisi PCR. Pemodifikasian dilakukan
dengan mengubah beberapa parameter, seperti, jumlah siklus, suhu Annealing, dan waktu
masing-masing tahapan PCR. Siklus berlangsung selama 35 kali dengan suhu Annealing
sebesar 56 C. Waktu denaturasi, annealing, dan ekstensi secara berurutan berdurasi 30,
30, dan 60 detik.

Kesimpulan
Untuk menganalisis DNA diperlukan keahlian dalam mengisolasi DNA sebagai
dasar. Juga diperlukan kemampuan memisahkan fragmen-fragmen DNA dengan
elektroforesis gel agarosa. Dan terakhir, diperlukan penguasaan teknik PCR guna
memperbanyak DNA secara cepat dari DNA template yang ada.
 DAFTAR PUSTAKA

Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Reece JB. 2016. Campbell Biology, Eleventh
Edition. New York(NY): Pearson Education.

Buwono ID, Kurniawati N, Iqbal M. 2016. Analisis perbandingan metode isolasi DNA untuk
deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada udang vaname (Litopenaeus vannamei).
Jurnal Perikanan Kelautan. 7(1): 54–65.

Feranisa A. 2016. Komparasi antara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Loopmediated
Isothermal Amplification (Lamp) dalam diagnosis molekuler. ODONTO Dental Journal.
3(2): 145–151. doi: 10.30659/odj.3.2.145-151.

Harahap MR. 2018. Elektroforesis: analisis elektronika terhadap biokimia genetika. CIRCUIT:
Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro. 2(1): 21–26. doi: 10.22373/crc.v2i1.3248.

Joko T, Kusumandari N, Hartono S. 2011. Optimasi metode PCR untuk deteksi Pectobacterium
carotovorum, penyebab penyakit busuk lunak anggrek. Jurnal Perlindungan Tanaman
Indonesia 17(2): 54–59.

Mulyani Y, Purwanto A, Nurruhwati I. 2011. Perbandingan beberapa metode isolasi DNA untuk
deteksi dini Koi Herpes Virus (KHV) pada ikan mas (Cyprinus carpio L.). Jurnal Akuatika
Indonesia. 2(1): 244185.

Rachmawati Y, Khoiriyah RA. 2018. Comparison of DNA isolation results with simple methods
and kits in samples of Psidium guajava leaves. Biotropic : The Journal of Tropical Biology.
2(2): 93–99. doi: 10.29080/biotropic.2018.2.2.93-99.

Santoso TJ, Hidayat SH, Herman M, Sudarsono. 2015. Aplikasi teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan primer degenerate dan spesifik gen AV1 untuk mendeteksi
begomovirus pada tomat (Lycopersicon esculentum Mill.). Jurnal Hortikultura Indonesia.
4(3): 140–149. doi: 10.29244/jhi.4.3.140-149.

Shetty PJ, Dairawan M. 2020. The evolution of DNA extraction methods. American Journal of
Biomedical Science & Research. 8(1): 39–45. doi: 10.34297/ajbsr.2020.08.001234.

Usman MY. 2016. Analisis Variasi Genetik Ikan Penja Indigenous Perairan Polewali Mandar
Sulawesi Barat dan Ikan Nike (Awaous sp.) Indigenous Perairan Gorontalo. [skripsi].
Makassar (ID): Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar.

Yustinadewi PD, Yustiantara PS, Narayani I. 2018. Teknik perancangan primer untuk sekuen
gen MDR-1 varian 1199 pada sampel buffy coat pasien anak dengan LLA. Metamorfosa:
Journal of Biological Sciences. 5(1): 105–111. doi: 10.2483/metamorfosa.2018.v05.i01.p16
Rachmawati R, Susilowati PE, Raharjo S. 2013. Analisis gen merkuri reduktase (merA) pada
isolat bakteri tambang emas Kabupaten Bombana Sulawesi Tenggara. Jurnal Progres
Kimia Sains. 3(2): 108-125.

Nugroho ED, Rahayu DA. 2018. Pengantar Bioteknologi: (Teori dan Aplikasi).Yogyakarta (ID):
Deepublish.

Guanghui M, Zhiguo S. 2013. Microspheres and Microcapsules in Biotechnology: Design,

Preparation, and Applications. Florida(FL): CRC Press.