Embrio ayam atau tikus

seluruh
gunungimunohistokimia 
prosedurberdasarkan protokol dan informasi yang diberikan oleh:  

Profesor Anthony Graham 

Profesor Biologi Perkembangan  
Neurobiologi Molekuler, Kedokteran  
Kings College London, Inggris 

Dr. Mattieu Vermeron  

Research Fellow 
Departemen Fisiologi, Perkembangan dan Ilmu Saraf,  
Universitas Cambridge , Inggris 

Prosedur berikut ini menjelaskan prosedur untuk pewarnaan seluruh bagian anak ayam atau
embrio tikus. Prosedur serupa dapat digunakan untuk pewarnaan embrio drosophila. Inkubasi
untuk fiksatif, buffer pemblokiran, antibodi, buffer pencuci, permeabilisasi dan pengembangan
warna substrat harus lebih lama dari imunositokimia / imunohistokimia normal untuk
memungkinkan permeabilisasi langsung ke tengah sampel. 

Prosedur: 

1. Pengambilan embrio: Anak 

ayam: Pecahkan telur dengan hati-hati ke dalam gelas kecil bersih berukuran sedang. Embrio
secara alami akan mengapung di atas kuning telur. Kemudian akan terlihat untuk dikeluarkan
dengan hati-hati menggunakan gunting bersih dan pipet Pasteur dengan ujungnya dilepas (ini
mencegah kerusakan embrio dari ujung sempit pipet). 

Tikus: Operasikan pada betina dewasa untuk membuang embrio. 

Membedah embrio dalam PBS dingin dan membuang sebanyak mungkin jaringan yang tidak
diinginkan. 

Kami merekomendasikan untuk membuang membran embrio dan jaringan berlebih sebanyak
mungkin karena hal ini dapat mencegah antibodi masuk ke dalam embrio. 

2. Tempatkan embrio dalam 5 ml bijous dalam 4% paraformaldehyde. Biarkan memperbaiki 4 C. o

Waktu yang dibutuhkan perlu optimasi. Kami menyarankan untuk mencoba antara 2 jam dan
semalam. 

ATAU perbaiki dalam m-DMSO (80% metanol, 20% DMSO) atau fiksatif pilihan lainnya. 

Umumnya fiksatif mana pun yang telah berhasil digunakan dengan antibodi saat digunakan
dalam cryoseksi, fiksatif ini harus cocok untuk seluruh pemasangan. Namun, ini mungkin
memerlukan beberapa pengoptimalan. 

Ketika sampel sepenuhnya diseimbangkan dengan fiksatif (yaitu fiksatif telah meresap ke seluruh
sampel) maka sampel harus tenggelam ke dasar larutan. Pastikan sampel telah tenggelam ke dasar
fiksatif sebelum melanjutkan. 
3. Cuci 3X dalam PBS 0,5 - 1% Triton tiga puluh menit setiap kali. 

4. Inkubasi embrio dua kali selama 1 jam dalam blok (PBS 1% Triton + 10% FCS + 0,2% Sodium

Azide), suhu kamar. 5. Inkubasi embrio dalam blok peroksidase (0,1% H O diencerkan dalam
2 2

buffer pemblokiran) semalaman 4 C. 6. Cuci embrio 2X di buffer pemblokiran

o

Temukan selengkapnya di abcam.com/technical 

7. Pindahkan embrio menggunakan pipet Pasteur dengan ujung dipotong menjadi tabung 2
ml. Tambahkan antibodi primer pada pengenceran / konsentrasi yang diperlukan. 

Direkomendasikan bahwa karena inkubasi bisa sangat lama pada pewarnaan keseluruhan,
antibodi harus diencerkan dalam buffer pemblokiran yang mengandung 0,02% natrium azida
untuk mencegah pertumbuhan mikroba. 

8. Inkubasi selama 1 sampai 4 hari dengan rotasi lembut pada4 C. 

suhuo

Waktu inkubasi ini akan membutuhkan beberapa optimasi tergantung pada antibodi dan

juga ukuran embrio. 9. Cuci embrio 3X 1 jam dalam PBS 1% Triton + 10% FCS 0,2%

natrium azida 

10. Cuci 3X 10 menit dalam PBS 1% Triton 

Cuci dengan baik untuk menghilangkan sisa natrium azida karena ini akan

menghambat aktivitas peroksidase saat berkembang 11. Tambahkan antibodi

sekunder dalam buffer pemblokiran (tanpa natrium azida) 

12. Induksi selama 2 hingga 4 hari dengan rotasi lembut 4 C 

o

13. Cuci 3X 10 menit dalam PBS 1% triton 

14. Inkubasi embrio dalam substrat DAB selama 2 hingga 3 jam RT. 

15. Pindahkan embrio ke piring dan tambahkan DAB segar ditambah 5 µl H O per 1 ml DAB. 
2 2

16. Bilas tiga kali dalam PBS setelah reaksi dan pewarnaan mencapai intensitas yang diinginkan 

17. Pasang dan lihat embrio. Simpan pada4 C sampai analisis. 

suhuo

Pemasangan: 

1. Tempatkan sampel dalam 100% gliserol selama 48 jam. Ketika sampel sepenuhnya
disetimbangkan dengan gliserol (yaitu tercampur sempurna dengan gliserol), sampel akan
tenggelam ke dasar botol. Pastikan sampel berada pada tahap ini sebelum melanjutkan. 

2. 75% gliserol memiliki kepadatan yang kira-kira sama dengan gelatin yang digunakan untuk
memasang dan mengatur sampel pada slide. Oleh karena itu, sampel harus disetimbangkan
dalam 75% gliserol setelah pewarnaan selama kurang lebih 15 menit (sekali lagi, ketika
disetimbangkan, sampel harus tenggelam). 

3. Masukkan gliserol 50% sampai sampel tenggelam. Embrio dapat dicitrakan pada tahap ini,
atau dipasang seluruhnya di gliserol pada slide. Gunakan minyak di sekitar tepi penutup kaca
untuk perlindungan. 

Jika sampel akan dimasukkan ke dalam gelatin dan dipotong di vibratome; tempatkan 20%
gelatin yang telah dihangatkan sebelumnya sampai 65 C. Biarkan selama sekitar 30 menit
o

untuk menyeimbangkan sebelum mengambil sampel untuk dipasang. Saat diimbangi dengan
gelatin, sampel harus tenggelam ke dasar.

Temukan lebih lanjut di abcam.com/technical 

Jurnal Nematologi 49 (1): 27-32. 2017. 

  The Society of Nematologists 2017. 

Teknik Ekspres Sederhana untuk Memproses Nematoda

untuk Koleksi Slide Mount 
ALEXANDER Y. RYSS 
Abstrak: Teknik sederhana baru fiksasi panas dan metode untuk memproses sejumlah massa nematoda
untuk menyiapkan slide koleksi nematoda untuk tujuan taksonomi dan ekologi, dikombinasikan dengan
pengurangan mendadak dari serangkaian prosedur yang disebabkan oleh prinsip "koktail" (stratifikasi lapisan
dengan gradien konsentrasi gliserol), dijelaskan. Kata kunci: koleksi slide, fiksasi, morfologi, nematoda,
teknik. 

Teknik yang paling populer untuk menyiapkan slide koleksi morfologi nematoda di antara ahli
nematologi tanah dan tanaman adalah metodologi yang dijelaskan oleh Seinhorst (1959, 1962),
yang meliputi fiksasi panas dan pemindahan cacing secara bertahap ke gliserol anhidrat. Teknik ini
(Seinhorst, 1959, 1962, 1966, 1974) dan modifikasi berikutnya (Netscher dan Seinhorst, 1969; De
Grisse, 1969; Ayoub, 1977; Huang et al., 1984; Hooper, 1986, 1990; Sulston dan Hodgkin, 1988;
Grewal, 1990; Poinar, 2010; De Ley et al., 2016; Hall, 1996; Ryss, 2003, 2015; Ferris, 2016)
sempurna dalam hasil morfologi akhir. Namun, tenaga kerja yang baik dan berkualitas tinggi
diperlukan untuk mentransfer nematoda individu dalam serangkaian larutan. Atau protokol
mencakup beberapa langkah substitusi manual solusi. Makalah ini bertujuan untuk mendeskripsikan
teknik yang sederhana dan cepat dalam memproses suspensi nematoda massa dari fiksatif menjadi
gliserol, dengan preparasi slide koleksi permanen selanjutnya. Perhatian khusus diberikan pada
morfologi atoda nem berkualitas tinggi. 

Materials DAN METHODS 

Fiksasi: Prinsip Seinhorst (1962, 1966, 1974) adalah dengan menambahkan fiksatif panas (4%
paraformaldehyde di 858C atau lebih tinggi) untuk nematoda hidup, dikelilingi oleh jumlah minimum
air, secepat mungkin (' 'membunuh'). Tahap fiksasi ini memastikan akses cepat fiksatif ke dalam
jaringan bagian dalam, sehingga dapat mengatasi hambatan pelindung kutikula kolagen-lipid.
Prinsip awal ini digunakan di sini dalam modifikasi yang diusulkan, dengan 4% formalin atau
trietanolamina formalin (TAF) (2 ml trietanolamina, 10 ml 40% untuk malin, dan air suling
ditambahkan ke volume akhir 100 ml). Untuk tujuan ini, dua tabung Eppendorf 1,5 ml disiapkan.
Salah satunya diisi dengan fiksatif, sedangkan suspensi nematoda ditempatkan pada tabung kedua.
Yang terakhir ditempatkan dalam posisi vertikal 

Diterima untuk publikasi 21 November 2016. 

Zoological Institute, Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, St. Petersburg 199034, Rusia. 
Penulis berterima kasih kepada Dr. Paulo Vieira dan Dr. Sergei A. Subbotin atas bacaan kritis dan catatan penting atas teks ini. 
Teknik ini telah dikembangkan untuk penelitian yang didukung oleh Yayasan Sains Rusia, nomor hibah 14-14-00621. 
E-mail: alryss@gmail.com. 
Makalah ini diedit oleh Sergei A. Subbotin. 
selama 10 menit untuk mengendapkan nematoda ke dasar (atau sebagai alternatif, menggunakan
langkah sentrifugasi 3.000 rpm selama 30 detik). Kemudian supernatan dihilangkan, menahan air di
1/3 dari bagian kerucut tabung (kira-kira 150 ml); atau, jika jumlah massa nematoda melebihi volume
150 ml, disarankan untuk menahan air pada ketinggian dua kali lipat dari tinggi suspensi nematoda.
Kedua tabung kemudian ditempatkan ke dalam '' pelampung '' (Gbr. 1H). '' Pelampung '' dapat
dengan mudah dibuat dari tutup ulir plastik botol polietilen tereftalat 500 ml (diameter 28 mm). Di
dalam tutupnya, diameter 8 mm. lubang bundar dibuat, yang sedikit kurang dari diameter tabung
Eppendorf untuk memastikan kontak yang erat dan oleh karena itu kemampuan mengambang yang
baik. Tutupnya harus diputar dari bawah ke atas dan tabung dimasukkan dengan erat ke dalam
lubang tutup. Sebelum fiksasi, kedua tabung (dengan fiksatif dan dengan suspensi nematoda)
dimasukkan ke dalam pelampung (Gbr. 1H). 
Tabung dengan fiksatif dipanaskan dalam bak air. Dalam kondisi lapangan, air dapat dipanaskan
sampai mendidih, kemudian dituang ke posterior wadah plastik tahan panas 0,75 - 1,5 liter (untuk
oven microwave). Tabung apung dengan fiksatif ditempatkan ke dalam wadah dengan air panas
selama 3 (2-4) menit (Gbr. 1G). Tabung kemudian dikeluarkan dan formalin yang dipanaskan
dipindahkan dengan menggunakan pipet plastik ke dalam tabung kedua yang berisi suspensi
nematoda (Gbr. 1H, I), yang karena sifat konduktif termalnya yang rendah dapat mempertahankan
suhu fiksatif yang tinggi. Tabung yang berisi nema todes dan fiksatif kemudian ditutup dan
dipindahkan kembali ke bak air. Untuk mengakhiri proses fiksasi, tabung dengan nematoda harus
disimpan dalam air panas minimal selama 1 jam (Gbr. 1J). Kemudian nematoda tetap dapat
disimpan dalam tabung untuk jangka waktu yang tidak terbatas, baik sebagai bahan pengumpul
atau nematoda dapat diproses menjadi preparasi slide setelah larutan mencapai suhu kamar. 
Pemrosesan nematoda tetap sampai gliserol pekat: Dianjurkan untuk memulai persiapan slide
dari suspensi nematoda yang dipanaskan dan dipanaskan sebelumnya hanya setelah mencapai
suhu kamar (15-258C). Untuk hasil terbaik, sebaiknya simpan nematoda dalam fiksatif minimal
selama 48 jam atau lebih. Selama periode ini, proses pengerasan jaringan dan kolagen
berlangsung. 
Untuk menjenuhkan tubuh nematoda dengan gliserol dalam suspensi nematoda massa, perlu
dibuat 
27

28 Journal of Nematology, Volume 49, No. 1, Maret 2017

FIG. 1. Fiksasi panas nematoda. A – C. Apung untuk tabung Eppendorf 1,5-ml: A, tampak atas dengan lubang tengah
untuk tabung; B, tampilan 3D dari float (tutup botol plastik); C, pelampung dengan tabung Eppendorf di dalamnya,
ditekan dengan kuat. D, E. Pemanasan air (gunakan salah satu cara ini): D, pemanasan dalam oven microwave; E,
pemanasan dalam ketel listrik dan kemudian dituangkan ke panci microwave tahan panas 1 liter. F. Menuangkan
formalin 4% (pada suhu kamar) ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml di dalam pelampung. G. Eppendorf tube dengan
formalin 4% didalamnya, 1008C selama 2 menit. H.Pindahkan formalin 4% panas ke dalam tabung Eppendorf dengan
nematoda hidup di dalam setetes air ('' membunuh ''). I. Nematoda dalam formalin 4% panas. Tabung J. Eppendorf
dengan nematoda terbunuh dalam formalin 4%: fiksasi lebih lanjut selama 1 jam dalam penangas air 908C.  

'' koktail '' bertingkat dari larutan gliserol-air yang mengandung rasio gliserol terhadap air yang
berbeda. Larutan terberat dalam berat jenis adalah gliserol anhidrat, yang paling mengapung adalah
air itu sendiri, dan larutan air-gliserol dapat diencerkan di antaranya tergantung pada kandungan
gliserol. Jika kita menambahkan gliserol pekat langsung ke nematoda tetap, struktur tubuh akan
rusak permanen. Oleh karena itu, saturasi nematoda dengan gliserol harus lambat dan bertahap,
dan kolom bertingkat dari `` koktail '' gliserol adalah alat terbaik untuk mencapai hal ini. Untuk
membuat kolom bertingkat, perlu untuk membatasi tetesan cairan mirip lensa agar tidak menyebar
di permukaan kaca; lilin lebah hidrofobik - cincin parafin bagus untuk tujuan ini. Untuk cincin,
digunakan campuran histologi lilin lebah dan parafin (1: 5) dengan titik leleh 658C. Sebuah cincin
harus dipasang pada kaca geser mikroskopis. Untuk membentuk cincin, digunakan benang katun
atau sutra yang digulung dalam 5 tangkai pada silinder plastik 20 mm (Gbr. 2A). Lebih baik
melembabkan utas agar mudah melingkar. Cincin benang adalah bingkai untuk cincin parafin-lilin
lebah. Yang pertama harus ditempatkan di tengah slide. Kemudian dua potong campuran lilin lebah-
parafin ditempatkan di ring dalam superposisi (Gbr. 2B, C). Slide dengan potongan cincin dan lilin
dipanaskan di atas hot plate (858C). Campuran lilin akan meleleh dan mengalir di sepanjang cincin
ulir, sehingga membentuk cincin hidrofobik akurat yang dipasang pada permukaan slide (Gbr. 2D,
E). Setelah didinginkan hingga suhu kamar, kaca objek dengan cincin dapat digunakan untuk
memproses nematoda menjadi gliserol. Ini dapat digunakan berulang kali untuk diproses. 
Setelah campuran lilin mendingin dan mengeras, dua tetes gliserol ditempatkan di bagian bawah
cincin; Tetesnya dioleskan pada permukaan kaca dengan kapas untuk membentuk lapisan gliserol
tipis (Gbr. 3C). Kemudian tiga tetes akuades ditempatkan di atas gliserol, 
sehingga membentuk lapisan yang akan melindungi nematoda dari kontak langsung dengan gliserol
pekat (Gbr. 3D). Nematoda cekat dicuci dengan air suling tiga kali, sehingga menghilangkan fiksatif
berlebih. Pada akhirnya, nematoda disimpan dalam lapisan air setinggi ½ dari tinggi bagian kerucut
dari tabung Eppendorf 1,5 ml (kira-kira 170 ml). Air dengan nematoda tetap diguncang dan
dituangkan perlahan dari atas pada kombinasi gliserol dan air di dalam cincin lilin (Gbr. 3E). Untuk
memaksimalkan jumlah nematoda yang terkumpul dari tabung, tabung nematoda dapat dicuci dua
kali lagi dengan setetes air suling. Akibatnya, lensa cair yang tinggi terbentuk di dalam cincin lilin
hidrofobik yang bertingkat-tingkat dalam kepadatan gliserol yang meningkat dari atas ke bawah.
Nematoda berada di atas di lapisan air, sedangkan lapisan tipis gliserol ada di bawah (Gbr. 3E).
Lensa '' koktail '' ini akan disimpan semalaman diterbuka 
 FIG. 2. Persiapan slide cincin lilin bersenjata. A. Gulungan benang pada silinder plastik (lima gubuk). B, C. Cincin benang
(th) di atas slide, didukung dengan serpihan lilin (w): B, tampak samping; C, tampilan atas. D, E. Geser dengan cincin ulir
setelah dipanaskan pada hot plate, lilin meleleh membentuk cincin lilin dengan ulir di dalamnya: D, tampak samping; E,
tampilan atas. 

Teknik Ekspres untuk Slide Koleksi: Ryss 29

FIG. 3. Pengolahan nematoda. A, B. Cincin lilin pada kaca objek (w: campuran lilin lebah-parafin): A, tampak samping;
B, tampilan atas. C. Masukan gliserol dari dasar cincin. D. Masukan air di atas lapisan gliserol. E.Masukkan suspensi
nematoda tetap untuk menyiapkan koktail 3 lapis. F. Setelah penguapan air 12 jam, nematoda berada dalam lapisan tipis
gliserol. G.Masukkan gliserol anhidrat untuk mengisi cincin lilin. H. Setetes gliserol anhidrat di tengah kaca objek. I, J.
Transfer nematoda dengan jarum, satu per satu, ke dalam tetesan gliserol: I, tampak samping; J, pemanasan untuk
menguapkan air dari suspensi nematoda dalam penurunan gliserol dan untuk saturasi nematoda yang lebih baik dengan
gliserol anhidrat. K. Orientasi nematoda dalam urutan garis di bawah tetesan gliserol, dengan jarum, tampak atas. L, M.
Penempatan penutup penutup pada pendukung lilin lebah-parafin, di atas bagian tengah tetesan gliserol dengan
nematoda. N. Sedikit pemanasan slide pada 858C (di atas hot plate) selama 3 sampai 5 detik untuk melunakkan
pendukung lilin. O, P. Menekan lembut kaca penutup dengan jari sampai menyentuh permukaan atas tetesan gliserol
dengan penutup kaca; indikasi tempat untuk menekan batas penutup kaca, di atas pendukung lilin yang dilunakkan
dengan panas. Q. Pemanasan baru pada hot plate 858C sampai lilin leleh mengelilingi tetesan gliserol dengan
nematoda. Slide perlu segera didinginkan hingga suhu kamar untuk menyelesaikan persiapan. R, S. Slide pengumpulan
siap pakai dengan nematoda dalam gliserol: area berbentuk spindel tengah yang dikelilingi tepi lilin di bawah penutup
penutup dan dua label inventaris (il) di sisi. 
udara pada suhu kamar, tertutup debu, memungkinkan penguapan air. Selama waktu ini, terjadi
peningkatan konsentrasi gliserol secara bertahap, menjenuhkan jaringan nematoda. Nematoda
perlahan-lahan akan tenggelam ke dalam lapisan gliserol yang lebih pekat. Setelah 12 jam, nema
todes berada dalam gliserol pekat di dalam ring. Pada tahap ini, mereka dapat dipelajari di bawah
mikroskop cahaya (Gbr. 3F). Suspensi nematoda dalam gliserol tersebut dapat disimpan sebagai
sampel koleksi dan disuplai dengan label ventilasi. Namun, untuk transportasi dan penyimpanan
jangka panjang, slide permanen harus disiapkan, yang meliputi (i) slide untuk tujuan ekologi
(suspensi nematoda dalam gliserol) dan (ii) slide nomic taxo nomic koleksi benar dengan spesimen
nematoda dalam gliserol dikelilingi oleh lilin tepi. 
Persiapan slide pengumpulan 
Persiapan slide suspensi untuk tujuan ekologis: Cincin lilin dilepas dengan hati-hati dari kaca
geser dengan menggunakan pisau bedah. Gliserol anhidrat kemudian ditambahkan hingga
menutupi semua nematoda secara merata pada area yang identik dengan kaca penutup 24 3 24
mm. Sebuah slide dipanaskan 10 menit pada hot plate yang diatur untuk 858C untuk
menghilangkan sisa air 
dan mempercepat infus gliserol ke dalam badan nematoda. Dalam kondisi lapangan, hot plate dapat
diganti dengan besi yang dibalik dari bawah ke atas dan diatur untuk 858C, `` mode sutra. '' Setelah
mendinginkan slide ke suhu ruangan, area gliserol ditutup dengan kaca penutup 24 3 24 mm. . Di
sudut-sudut kaca penutup, ditambahkan empat lembar campuran lilin lebah-parafin (1: 5, titik leleh
658C) dan kemudian kaca objek dipanaskan pada hot plate (858C) sampai lilin meleleh dan
mengalir, sehingga mengelilingi kaca penutup untuk membentuk tepi. Slide siap setelah diberi label. 
Kadang-kadang perlu untuk mengambil spesimen nematoda dari slide suspensi dan untuk
menyiapkan slide taksonomi standar koleksi. Ini dapat dilakukan dengan membuka slide
menggunakan pisau bedah di sepanjang tepi lilin. Dua tetes gliserol harus ditambahkan pada tepi
kaca penutup 24- 3 24 mm. Penutup penutup akan mengapung dan dapat dengan mudah
dipindahkan. Nematoda dapat diambil dengan jarum dari suspensi gliserol untuk menyiapkan slide
pengumpulan standar. 
Persiapan slide koleksi standar: Setetes kecil gliserol ditempatkan pada slide mikroskopis bersih
(Gbr. 3H); 

30 Journal of Nematology, Volume 49, No.1, Maret 2017

 FIG. 4. Foto spesimen nematoda, disiapkan dengan teknik ekspres. Paraphelenchus pseudoparietinus, betina: A, garis
bentuk tubuh; B, bagian anterior; C dengan aksen kepala; D, sistem genital; E, ujung anterior ovarium; F, vulva, vagina,
dan uterus; G dengan aksen ekor. Skala 50 mm untuk A dan D; 20 mm untuk B, E, F, dan G; dan 10 mm untuk C.  

kemudian nematoda yang difiksasi dan diproses menjadi gliserol anhidrat diambil dengan jarum
halus. Mereka ditransfer secara individual ke dalam tetesan gliserol. Untuk nematoda yang
termasuk dalam spesies yang sama, jumlah spesimen yang disarankan ditempatkan pada satu slide
koleksi dapat bervariasi dari 1 hingga 10 (lebih disukai dengan kemampuan 4–5), menggabungkan
spesimen dewasa dari kedua jenis kelamin. Slide dipanaskan pada hot plate (858C) selama 10
menit untuk menghilangkan sisa air, untuk mempercepat infus gliserol ke dalam badan nematoda,
dan untuk menghilangkan sedikit deformasi nematoda (Gbr. 3I, J). Kemudian, di bawah mikroskop
stereomik, nematoda dibenamkan dengan jarum di bagian bawah, dan disusun dalam satu atau dua
baris (Gbr. 3K). Penempatan nematoda di dasar sangat penting, untuk mencegahnya melayang ke
tepi lilin selama tahap persiapan berikutnya. Lilin kemudian dipanaskan sebentar untuk membuatnya
lembut, dan dua titik lilin kecil ditempatkan secara diagonal dengan pisau bedah (Gbr. 3L, M). Selip
penutup berukuran 18 3 18 mm ditempatkan di atas tetesan gliserol pada bercak lilin, sehingga
berfungsi sebagai penyangga diagonal dari kaca penutup. Pusat selip selip harus ditetapkan tepat di
atas tetesan gliserol (Gbr. 3M). Slide dipanaskan sedikit (1–5 detik) di atas hot plate 858C untuk
melunakkan penyangga lilin. Tepi 
penutup kaca penutup kemudian ditekan dengan jari secara perlahan agar tetesan gliserol
menyentuh kaca penutup, membentuk meniskus transparan yang lebar, di mana barisan nematoda
dapat terlihat (Gbr. 3O, P). Penanganan harus dilakukan dengan hati-hati, jika tidak, nematoda
dapat berubah posisinya, berpindah ke pinggiran dan kemudian ke tepi lilin. Setelah kontak pertama
kaca penutup dan tetes, kaca objek harus dipanaskan kembali sampai lilin meleleh dan mengalir di
sekitar tetes gliserol (Gbr. 3Q). Setelah slide mendingin, preparasi slide koleksi selesai, dengan satu
atau dua baris nematoda di dalam tetesan gliserol yang dikelilingi tepi lilin (Gbr. 3R, S). Dua label
inventaris kemudian ditempelkan pada slide di area samping (Gbr. 3S, il). Satu label yang berisi
informasi identifikasi spesies nematoda: nama latin nema todes, nama pengidentifikasi taksonom,
dan tanggal identifikasi spesies. Label kedua mencakup data pengumpulan: lokasi dan tanggal
 pengambilan, nama kolektor, serta slide di nomor ventori. Beberapa data pada label ini dapat diganti
dengan kode yang digunakan dalam database koleksi. Direkomendasikan untuk memasukkan data
GPS di label kedua atau dalam database koleksi. Foto 

spesimen nematoda yang dipasang pada slide koleksi dengan menggunakan teknik ini diberikan
pada Gambar 4. 
Untuk nematoda dengan diameter tubuh lebih dari 40 mm, disarankan untuk menambahkan
penyangga penutup kaca dengan diameter proporsional (batang kaca, serat nilon, dan manik-
manik) di dekat dua titik lilin sebelum memasang kaca penutup. Jika tidak, kaca penutup dapat
menyebabkan de formasi morfologi yang mengakibatkan spesimen menjadi rata. Setelah lilin
meleleh, penyangga keras tambahan ini akan ditaburkan ke tepi lilin. 
Slide koleksi dengan nematoda dipasang di antara dua kaca penutup: Kadang-kadang sangat
berguna untuk menyiapkan slide koleksi dengan nematoda dipasang di antara dua kaca penutup.
Pengguna dapat memutar slide untuk melihat morfologi nematoda dari dua sisi yang berlawanan.
Untuk membuat slide tersebut, digunakan dua buah kaca penutup, satu besar (24 3 24 mm) dapat
digunakan sebagai alas dan yang kedua kecil (18 3 18 mm) digunakan sebagai penutup. Kaca
penutup besar harus dipasang ke rangka aluminium Cobb atau ke slide mikroskopis biasa dengan
label atau pita lengket. Pada kaca penutup besar, setetes kecil gliserol ditempatkan. Spesimen
nematoda tetap dan yang diproses gliserol milik spesies yang sama dipindahkan ke dalam tetesan
dengan jarum. Tahap-tahap persiapan slide selanjutnya adalah sama seperti yang dijelaskan di atas
untuk persiapan slide koleksi standar. 
Umur koleksi slide: Menurut pengalaman penulis, morfologi nematoda yang dipasang pada slide
yang dibuat pada tahun 2010 masih sebaik pada saat pembuatan. Kualitas morfologi nematoda
sangat tergantung pada durasi prosedur fiksasi. Fiksasi 2 jam memungkinkan kualitas morfologi
yang baik. Namun, pada spesimen nematoda yang difiksasi selama dua hari atau lebih, jaringan
bagian dalam yang mengeras yang dihasilkan memberikan kualitas morfologi yang lebih baik. 
Risiko lain adalah ketika spesimen menjadi rata selama masa pakai slide yang lama. Ini dapat
terjadi jika parafin tanpa lilin lebah digunakan sebagai penyegel. Parafin memiliki struktur seperti
kristal berpori pada suhu kamar. Setelah beberapa tahun, gliserol dapat secara bertahap tersedot
keluar dari zona pusat slide karena aksi kapiler dari tepi parafin. Nematoda bisa menjadi kering atau
rata pada dudukan geser. Untuk menghindari efek '' kertas saring '' ini, campuran amorf lilin lebah-
parafin (1: 5, titik leleh 658C) harus digunakan sebagai penyegel dan bukan parafin itu sendiri. 

DISKUSI 

Kebaruan dari teknik ini memungkinkan pemrosesan massal berbagai jenis sampel nematoda
dalam suspensi, dengan pengurangan waktu dan rangkaian prosedur secara tiba-tiba, difasilitasi
oleh stratifikasi lapisan yang terdiri dari campuran konsentrasi gliserol-ke-air dengan konsentrasi
yang berbeda. kepadatan ('' koktail ''). Prinsip dasar dasar fiksasi panas tetap tidak berubah, tetapi
tahap pemrosesan dikurangi menjadi satu langkah. Slide cincin lilin yang diusulkan dengan 
Teknik Ekspres untuk Slide Koleksi: SuspensiRyss 31

nematodadapat disimpan sebagai unit koleksi. Mereka siap untuk studi mikroskopis kapan saja
tanpa prosedur tambahan. Mereka berguna untuk memastikan keandalan data ekologi yang
dipublikasikan berdasarkan bahan nematoda (Gbr. 5). 
TAF panas (858C) dan formalin 4% panas digunakan sebagai fiksatif. Keduanya cocok untuk
teknik pemrosesan gliserol yang dijelaskan di sini. FA fiksatif (campuran asam asetat 1% dan
formaldehida 4% dalam air suling) dikeluarkan karena hasil yang tidak stabil: asam asetat tidak
dapat dicuci sepenuhnya dari struktur internal, dan selama penyimpanan jangka panjang, struktur
nematoda menjadi lebih dan lebih transparan. Selain itu, asam asetat membuat struktur menjadi
terlalu lunak, dan selama pemrosesan suspensi massa nematoda melalui campuran gliserol-air,
beberapa nematoda dapat mengalami deformasi pada pemasangan slide akhir. TAF tampaknya
menjadi fiksatif terbaik dibandingkan dengan formalin 4% panas dalam satu fitur tambahan: setelah
setidaknya 3 tahun dalam slide gliserol, spesimen tetap TAF dapat dikeluarkan dari slide dan
diwarnai dengan noda nukleat (seperti asetat orcein), sedangkan 4% nematoda berformalin tidak
dapat diwarnai. Namun, spesimen yang difiksasi dalam formaldehida 4% panas lebih kaku daripada
spesimen yang difiksasi dalam TAF panas. Untuk menghindari kemungkinan penyusutan beberapa
nematoda tebal selama pemrosesan cepat gliserol-air dari suspensi nematoda multispesies, akan
aman untuk menggunakan formalin 4% panas sebagai fiksatif. 
 Dalam teknik persiapan yang dijelaskan di sini, etha nol tidak digunakan. Biasanya dalam teknik
fiksasi dan preparasi etanol memiliki dua fungsi: (i) dapat menjadi fiksatif tambahan jika campuran
etanol-gliserol-air 5% ditambahkan tepat setelah pembunuhan yang sangat singkat dengan formalin
4% panas atau TAF dan (ii) memungkinkan lebih cepat infus gliserol ke jaringan nematoda,
sehingga menggantikan air sisa bagian dalam. Dalam pemrosesan cepat suspensi nematoda
massa, nematoda terkecil dapat menyusut selama penambahan larutan yang mengandung etanol.
Oleh karena itu 

FIG. 5. Suspensi nematoda massa dalam gliserol, pada

kaca geser cincin. 
32 Journal of Nematology, Volume 49, No.1, Maret 2017

etanol tidak termasuk. Tetapi pemanasan 10 menit pada 858C digunakan dalam teknik yang
diusulkan untuk menguapkan air sisa dari nematoda tetap dan untuk mempercepat infus gliserol ke
dalam badan nematoda. Pemanasan digunakan ketika spesimen nematoda ditempatkan dalam
setetes kecil gliserol pada kaca geser. Dalam slide suspensi '' ekologis '', cincin parafin-lilin lebah
dilepas dengan skal pel, dan kemudian kaca objek dengan suspensi nematoda total dipanaskan di
atas hot plate 858C selama 10 menit sebelum penutup dan penyegelan slip penutup. 

LITERATUR CITED 

Ayoub, SM 1977. Nematologi tanaman: Bantuan pelatihan pertanian. Pp. 105–109. Sacramento, CA: Departemen Pangan
dan Pertanian California. 
De Grisse, AT 1969. Penjelasan ulang teknik modifikasi de quelques menggunakan fitoparasita dans l'etude des
nematodes. Meded. Rijksfakulteit Landbowwetenschappen Gent 34: 351–369. 
De Ley, P., Blaxter, M., dan Giuliano, D. 2016. Ekstraksi, pemasangan dan pemasangan nematoda. (22 September 2016).
Halaman Muka WORMWOOD WWW (Sumber daya untuk filogeni nematoda). http: //xyala.cap.
ed.ac.uk/research/nematodes/fgn/worm/extrafix.html. 
Ferris, H. 2016. Gunung nematoda permanen. (22 September 2016). Davis, CA: Nemaplex. Universitas California Davis.
http: // plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Methods/Permanen.html. 
Grewal, PS 1990. Penggunaan agar-agar sebagai penyangga kaca penutup untuk memasang nematoda. Revue de N
ematologie 13: 121–122. Hall, GS, ed. 1996. Metode untuk pemeriksaan keanekaragaman organisme di tanah dan sedimen.
Pp. 307. Wallingford, Raja Bersatu dom: CAB International. 

Hooper, DJ 1986. Penanganan, pemasangan, pewarnaan dan pemasangan nematoda. Pp. 59–80 dalam JF Southey, ed.
Metode laboratorium untuk bekerja dengan nematoda tanaman dan tanah. London, Inggris Raya: MAFF. 
Hooper, DJ 1990. Ekstraksi dan pengolahan nematoda tanaman dan tanah. Pp. 45–68 dalam M. Luc, RA Sikora, dan J.
Bridge, eds. Tanaman nematoda parasit di pertanian subtropis dan tropis. Wall ingford, Inggris Raya: CAB International. 
Huang, CS, Bittencourt, C., dan Mota Silva, EFS 1984. Pra-pengupas pemasangan nematoda permanen dengan pita
perekat. Jurnal Nematologi 16: 341-342. 
Netscher, C., dan Seinhorst, JW 1969. Asam propionat lebih baik dari asam asetat untuk membunuh nematoda.
Nematologica 15: 286. Poinar, GO, Jr. 2010. Nematoda dan Nematomorpha. Bab 9. Hal. 237–276 dalam JH Thorp dan AP
Covich, eds. Ekologi dan klasifikasi invertebrata air tawar Amerika Utara. London, Inggris Raya: Academic Press, Elsevier. 
Ryss, A. 2003. Teknik ekspres untuk menyiapkan slide koleksi nematoda. Zoosystematica Rossica 11: 257–260. 
 Ryss, AY 2015. Teknik paling sederhana untuk deteksi dan budidaya laboratorium nematoda layu tanaman berkayu.
Izvesitiya Sankt-Peterburgskoi Lesotekhnicheskoi Akademii 211: 287–295. (Dalam bahasa Rusia). 
Seinhorst, JW 1959. Metode cepat untuk transfer nematoda dari fiksatif ke gliserin anhidrat. Nematologica 4: 67–69.
Seinhorst, JW 1962. Tentang pembunuhan, pengikatan dan pemindahan nematoda ke gliserin. Nematologica 8: 29–32. 
Seinhorst, JW 1966. Membunuh nematoda untuk studi taksonomi dengan fa 4: 1. Nematologica 12: 175. 
Seinhorst, JW 1974. Seberapa kecil setetes air? Nem atologica19: 121. 
Sulston, J., dan Hodgkin, J. 1988. Metode. Pp. 587–606 dalam WB Wood, ed. Nematoda Caenorhabditis elegans. Cold
Spring Harbor, NY: Laboratorium Cold Spring Harbor.