Metode parafin yang digunakan dalam acara ini mengacu pada metode McManus & Mowry

(1960), Disbrey & Rack (1970), Suntoro (1983), dan Bancroft & Cook (1984) dengan
modifikasi.
1. Narkose

Tikus putih dikorbankan dengan dibius menggunakan kloroform. Senyawa ini mudah terbakar
sehingga dalam penggunaannya harus hati-hati.
2. Pengambilan organ

Tikus putih yang telah dikorbankan selanjutnya diletakkan dengan posisi abdomen
menghadap ke atas di kotak parafin. Kedua pasang tungkai 13
difiksir menggunakan jarum preparat/jarum pentul. Rambut tikus disisihkan ke samping kanan
dan kiri menggunakan kapas basah supaya tidak mengganggu pengambilan jaringan/organ.
Jaringan/organ yang telah diambil dicuci dengan larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%). Organ
diiris dengan ketebalan sekitar 3-5 mm/seluas 1 cm2. Pengambilan organ untuk keperluan
penelitian dapat merujuk pada metode pengambilan organ yang dilakukan oleh Ruehl-Fehlert
et al. (2003), Kittel et al. (2004), dan Morawietz et al. (2004).
3. Fiksasi

Jaringan/organ yang akan diproses segera dimasukkan ke dalam botol flakon berisi larutan
fiksatif. Pada praktikum ini digunakan larutan Bouin. Lama fiksasi di dalam larutan Bouin
sebaiknya antara 3 – 12 jam. Perbandingan antara volume jaringan/organ dengan larutan
fiksatif minimal 1 : 10. Larutan Bouin mengandung asam pikrat yang dapat meledak apabila
dalam kondisi kering sehingga penggunaannya harus hati-hati.
4. Washing/Pencucian

Apabila digunakan larutan Bouin sebagai fiksatif maka jaringan/organ dicuci dengan alkohol
70%, sampai warna kuning berkurang. Pada proses washing,alkohol 70% dapat diganti setiap
30 menit/satu jam sekali. Proses ini dapat diulang beberapa kali sampai warna kuning
menghilang.
5. Dehidrasi

Dilakukan dengan menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi 70, 80, 90, 96%, sampai
dengan absolut. Proses dehidrasi dapat dilakukan dengan lama waktu sebagai berikut:
Alkohol 70% 4 X 30 menit
Alkohol 80% 2 X 30 menit
Alkohol 90% 2 X 30 menit
Alkohol 96% 1 X 30 menit
Alkohol absolut 1 X 30 menit
6. Clearing (dealkoholisasi)

Proses ini dilakukan untuk menarik keluar alkohol yang terdapat di dalam jaringan/organ
dengan menggunakan toluol sehingga pada saat infiltrasi, parafin cair dapat memasuki
jaringan/organ. Apabila proses clearing berhasil dengan baik maka biasanya jaringan akan
tampak transparan meskipun ada beberapa jaringan/organ yang tidak tampak transparan
meskipun telah clear dari alkohol. Pada proses ini jaringan/organ dari alkohol absolut
kemudian direndam dalam botol timbang berisi toluol selama semalam/overnight. 14
7. Infiltrasi

Proses ini dilakukan untuk memasukkan parafin cair ke dalam jaringan/organ. Infiltrasi
dilakukan di dalam oven yang suhunya telah diatur pada 60C. Suhu tersebut ditentukan
karena parafin yang digunakan memiliki titik lebur 57-60 C. Pada proses infiltrasi,
jaringan/organ dimasukkan ke dalam satu set gelas beker ukuran 50 mL/botol balsam kecil
menggunakan pinset dengan urutan sebagai berikut:
Campuran toluol/parafin (1:1) 30 menit
Parafin I 50 menit
Parafin II 50 menit
Parafin III 50 menit
Pada proses infiltrasi, jaringan/organ harus diusahakan seminimal mungkin kontak dengan
udara sehingga parafin dapat masuk ke dalam jaringan/organ secara merata.
8. Embedding

Proses ini dilakukan untukmenanam jaringan/organ yang telah diinfiltrasi ke dalam parafin
padat. Sehari sebelum proses embedding sebaiknya dipersiapkankotak-kotak kecil berukuran
1 cm2 atau 1 x 1,5 cm2. Kotak tersebut dibuat dengan menggunakan kertas yang agak tebal
(misal kertas kalender atau kertas bekas pembungkus kertas HVS). Apabila memiliki kotak
dari fiber, khusus untuk proses embedding maka akan lebih baik karena proses embedding
dapat dilakukan dengan menggunakan kotak tersebut. Selanjutnya dipersiapkan pula parafin
murni dengan titik lebur 57 – 60 C sebanyak 100 – 150 g. Parafin tersebut diletakkan ke
dalam gelas beker dan dimasukkan ke dalam oven supaya mencair.
Kemudian proses embedding dilakukan sebagai berikut:
a. Parafin cair dituangkan ke dalam kotak untuk embeddingtersebut sampai penuh.
b. Jaringan/organ yang telah diinfiltrasi dipindahkan dengan cepat ke dalam kotak berisi
parafin cair dengan menggunakan pinset yang telah dipanaskan sebentar di atas lampu
Bunsen.
c. Jaringan/organ di dalam kotak diatur sesuai dengan arah pengirisan yang dikehendaki
(melintang atau membujur). Untuk potongan melintang maka jaringan/organ diletakkan
dengan posisi berdiri di dalam kotak sedangkan untuk potongan membujur maka
jaringan/organ diletakkan dengan posisi horizontal di dalam kotak.
15
Pada proses ini harus dihindari supaya tidak terdapat gelembung udara di sekitar
jaringan/organ sehingga pada saat diiris menggunakan pisau mikrotom jaringan/organ tidak
lepas. Jaringan/organ yang telah ditanam dalam parafin tersebut selanjutnya disebut sebagai
“blok”.
d. Setiap blok harus diberi labelyang mencantumkan nama jaringan, nama pemilik, golongan
praktikum, arah potongan, dan tanggal.
e. Parafin cair dalam kotak berisi jaringan/organ tersebut akan memadat dengan baik sekitar 3
jam setelah proses embedding.
9. Triming

Proses ini dilakukan untuk menempelkan blok ke holder kayu sehingga mempermudah proses
sectioning/pengirisan. Blok yang telah memadat dikeluarkan dari kotak. Bagian cekung dari
blok tersebut dirapikan dengan cara diiris sedikit menggunakanskalpel sehingga
permukaannya sama rata. Bagian blok yang berlawanan dengan bagian cekung tersebut diiris
dengan arah miring pada keempat sisinya (± 3 mm dari tepi jaringan/organ) sehingga
terbentuk bangunan trapesium. Selanjutnya blok ditempelkan ke atas holder kayu dengan
menggunakan parafin yang telah dipanaskan di atas lampu Bunsen menggunakan spatel.
Keempat sisi blok yang telah menempel di atas holder sebaiknya juga dilekatkan ke holder
menggunakan parafin yang telah dipanaskan tersebut supaya blok tidak mudah lepas saat
sectioning. Sebelum sectioning blok dapat didinginkan di dalam lemari es suhu 4 C minimal
selama sepuluh menit. Pada bagian bawah holder kayu yang telah ditempeli blok sebaiknya
juga diberi label yang berisi informasi terkait jaringan/organ yang akan diproses tersebut.
10. Sectioning

Proses ini dilakukan untuk mengiris blok dengan ketebalan ± 6 μm menggunakan pisau
mikrotom. Pada praktikum ini digunakan rotary microtome.
Proses sectioning dilakukan sebagai berikut:
a. Holder kayu dengan blok parafin di pasang pada mikrotom putar dan dieratkan sesuai
dengan petunjuk pemakaian.
b. Pada bagian depan mikrotom sebaiknya diberi alas dari karton berwarna hitam sebagai
tempat untuk meletakkan pita/coupes hasil pengirisan.
c. Kuas kecil dipersiapkan untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom. Perlu diperhatikan
bahwa pisau, pinset, atau peralatan logam lain tidak boleh digunakan untuk mengambil
coupes dari pisau mikrotom.
16
d. Setelah semua siap selanjutnya pisau mikrotom dipasang di tempatnya pada mikrotom,
dieratkan. Penggunaan mikrotom dilakukan sesuai dengan petunjuk pemakaian.
e. Sebelum dan setelah selesai memotong, pisau mikrotom diusap terlebih dahulu dengan
xilol.
f. Sebelum sectioning mikrotom diatur pada skala 6 μm sehingga potongan yang dihasikan
memiliki ketebalan 6 μm. Coupesyang diperoleh diletakkan diatas karton hitam. Diusahakan
susunannya jangan sampai terbalik/tercampur.
11. Afiksing

Proses ini dilakukan untuk menempelkan coupes pada kaca benda bersih dan bebas lemak
menggunakan Meyer’s albumin.
Salah satu proses afiksing dapat dilakukan sebagai berikut:
a. Sebuah kaca benda bersih dan bebas lemak dipersiapkan.
b. Satu tetes kecil Meyer’s albumin(diambil menggunakan kapiler hematokrit) diteteskan di
atas kaca benda tersebut.
c. Meyer’s albumin digosokkan secara merata ke seluruh bagian kaca benda.
d. Selanjutnya akuades diteteskan secukupnya di atas kaca benda tersebut.
e. Coupes di atas karton hitam dipilih yang terbaik (utuh) misal dua atau tigacoupes. Coupes
dipotong menggunakan skalpel dan diletakkan di atas akuades tersebut.
f. Coupes di atas kaca benda tersebut sebaiknya jangan diletakkan terlalu ke tepi.
g. Kaca benda tersebut kemudian dipindahkan ke atas hot plate yang suhunya telah diatur ±
45oC.
h. Letak coupes diatur dan parafin direntangkan. Apabila terdapat kelebihan akuades maka
sebaiknya dihisap menggunakan pipet tetes atau tisu.
i. Pada bagian tepi kaca benda tersebut diberi label berisi nama pemilik, nama organ, arah
potongan, dan tanggal.
j. Kaca benda berisi coupes sebaiknya dibiarkan di atas hot plate selama ± 24 jam. Apabila
coupes telah dikeringkan di atas hot plate selama ± 24 jam dan belum akan diwarnai maka
dapat disimpan di dalam map preparat/kotak preparat.
17
Apabila ingin membuat preparat dalam jumlah lebih dari satu maka proses a sampai j dapat
diulang sebanyak jumlah preparat yang dikehendaki untuk dibuat.
12. Staining

Proses ini dilakukan untuk mewarnai copues. Pada praktikum ini dilakukan 2 metode
pewarnaan yaitu pewarnaan Ehrlich hematoksilin-eosin (H-E) dan Mallory Acid Fuchsin (MAF).
Sebelum proses pewarnaan dilakukan deparafinasi terlebih dahulu. Slide (kaca benda yang
telah ditempeli preparat) direndam dalam staining jar berisi xilol I minimal selama 15
menit/sampai parafin yang terdapat di coupes larut. Proses deparafinasi yang tidak sempurna
akan menghalangi proses pewarnaan.
Prosedur pewarnaan H-E dan MAF adalah sebagai berikut:
a. Ehrlich hematoksilin-eosin
- Setelah proses deparafinasi dilakukan dengan sempurna, xilol yang terdapat di coupes
dihisap dengan kertas saring/tisu.
- Selanjutnya slide dicelupkan dua atau tiga kali celupan ke dalam etanol(alkohol) 96, 90, 80,
70, 60, 50, 30%, dan akuades.
- Slide direndam ke dalam Ehrlich hematoksilin selama tiga sampai tujuh detik.
- Slide dicuci menggunakan air mengalir selama sepuluh menit.
- Slide diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah inti sudah terwarnai biru dan jelas.
- Slide dicelupkan dua atau tiga kali celupan ke akuades, etanol(alkohol) 30, 50, 60, dan 70%.
- Slide direndam dalam eosin Y (1 – 2% eosin Y dalam alkohol 70%) selama satu sampai dua
menit.
- Slide dicuci menggunakan alkohol 70% (boleh menggunakan alkohol 70% bekas).
- Slide diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah sitoplasma sudah terwarnai merah
muda, jelas, dan terlihat kontras dengan inti.
- Slide dicelupkan dua atau tiga kali celupan ke etanol(alkohol) 70, 80, 90, dan 96%.
- Slide dikeringkan menggunakan kertas saring/tisu.
- Slide direndam dalam xilol untuk proses clearing selama minimal 30 menit.
- Slide ditutup/dimounting menggunakan Canada balsam/entelan dan diberi label.
18
b. Mallory Acid Fuchsin
- Setelah proses deparafinasi dilakukan dengan sempurna, xilol yang terdapat di coupes
dihisap dengan kertas saring/tisu.
- Selanjutnya slide dicelupkan dua atau tiga kali celupan ke dalam alkohol (etanol) 96, 90, 80,
70, 60, 50, 30%, dan akuades.
- Slide direndam ke dalam acid fuschin selama dua menit.
- Slide dicuci menggunakan akuades beberapa kali celup.
- Slide diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah warna sudah sesuai dengan yang
dikehendaki.
- Slide direndam ke dalam PMA (phospho molibdic acid) selama lima menit.
- Slide dicuci menggunakan akuades beberapa kali celup.
- Slide diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah warna sudah sesuai dengan yang
dikehendaki.
- Slide direndam ke dalam Mallory selama tiga menit.
- Slide dicuci menggunakan akuades beberapa kali celup.
- Slide diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah warna sudah sesuai dengan yang
dikehendaki.
- Slide dicelupkan dua atau tiga kali celupan ke akuades, etanol(alkohol) 30, 50, 60, 70, 80,
90, dan 96%.
- Slide dikeringkan menggunakan kertas saring/tisu.
- Slide direndam dalam xilol untuk proses clearing selama minimal 30 menit.
- Slide ditutup/dimounting menggunakan Canada balsam/entelan dan diberi label.

13. Mounting

Proses mounting dilakukan untuk memberi perekat transparan yang memiliki indeksbias sama
dengan indeksbias kacabenda dan kaca penutup. Perekat ini disebut mountant.
Proses mounting dilakukan sebagai berikut:
a. Slide yang telah diwarnai dan telah diclearing menggunakan xilol selanjutnya dikeluarkan
dari staining jar.
b. Slide diletakkan di atas meja kerja dengan preparat menghadap ke atas.
c. Selanjutnya preparat ditetesi dengan Canada balsam/entelan (jumlah tetesan tergantung
dari besar/kecilnya preparat).
19
d. Kaca penutup diposisikan miring dan ditopang oleh jarum preparat diletakkan ditepi
preparat
e. Secara perlahan-lahan, kaca benda tersebut diturunkan sehingga apabila terdapat
gelembung udara maka gelembung udara tersebut dapat dikeluarkan.
f. Slide yang telah dimounting selanjuntya diletakkan di atas hot plate selama semalam supaya
Canada balsam mengering. Apabila menggunakan entelan maka cukup dikeringkan pada
suhu ruang.