PEDOMAN PRAKTIKUM

SITOHISTOTEKNOLOGI

Oleh :

I GUSTI AGUNG DEWI SARIHATI

I GUSTI AGUNG AYU PUTU SWASTINI
LUH PUTU RINAWATI
NI KADEK ARI DWIYANTI

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES
DENPASAR
2021
A. Prosedur Kerja
Rangkaian proses pembuatan preparat histologi terdiri atas :
1. Fiksasi (Fixation)
2. Dehidrasi (Dehydration) Tahapan pada Tissue

3. Pembeningan (Clearing) Automatics Processor

4. Pembenaman (Impregnasi/Embedding)
5. Pengecoran (Blocking)
6. Pemotongan jaringan (Cutting)
7. Pewarnaan (Staining)
8. Perekatan (Mounting)
9. Pengamatan

Isolasi ( pengambilan ) jaringan tubuh

A. Persiapan
Sebelum jaringan tubuh (tikus ataupun mencit) diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan
yang terdiri atas :
1. Persiapan alat dan bahan/cairan
Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau
pengambilan jaringan terdiri atas peralatan bedah minor (gunting, pinset, dan jarum
pentul), meja operasi, chloroform, perangkat pengawetan jaringan (fiksasi jaringan)
seperti wadah untuk fiksasi, cairan fiksasi (formalin).
2. Persiapan sampel
Untuk sampel yang diambil dari hewan, maka hewan perlu dipersiapkan terlebih
dahulu. Hewan yang dipilih haruslah sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai
status gizi yang baik dan dipelihara sesuai dengan syarat-syarat pemeliharaan hewan
coba.

B. Pelaksanaan
Tahapan pengambilan jaringan adalah sebagai berikut
1. Pembiusan
Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan dengan
a. Diletakkan mencit dalam gelas kimia yang berisi tisu.
b. Kemudian diteteskan chloroform (jangan sampai mengenai mencit saat meneteskan
chloroform) dan ditutup rapat.
 c. Ditunggu sampai mencit benar – benar pingsan.
2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh
Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan operasi
dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. Hewan dibaringkan di atas meja
operasi (gabus), dan tubuh dalam posisi anatomi dengan kaki dan tangan ditusuk
dengan jarum pentul agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan
sayatan pada garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan
bawah. Diafragma lalu dibuka. Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang
sternum lalu ditarik ke atas. Jaringan tubuh lalu dipotong-potong didalam cairan
fisiologis (NaCl 0.9%) untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil. Hal ini perlu
dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam jaringan dengan mudah dan baik.
Potongan jaringan kemudian dimasukkan kedalam wadah-wadah kecil yang telah
diberikan label/keterangan. Wadah berisi cairan fiksasi dan jaringan direndam 24 jam,
kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat pemerosesan jaringan
selanjutnya.
Rangkaian pembuatan preparat :
1. UPS dipersipakan terlebih dahulu
a. Menyalakan UPS
1) Sambungkan UPS pada sumber listrik
2) Tekan secara bersamaan tombol Tengah & Bawah (pada sisi kiri UPS),
selama 5 detik, Perhatikan indikator lampu (pada sisi kanan
UPS)→indikator ke-3 menyala ( lampu warna kuning)
3) Tekan secara bersamaan tombol Tengah & Bawah (pada sisi kiriUPS),
selama 5 detik
4) Perhatikan indikator lampu (pada sisi kanan UPS)→indikator ke-1 menyala
(lampu warna Hijau)
5) UPS siap digunakan
b. Mematikan UPS
1) Perhatikan indikator lampu (pada sisi kanan UPS)→indikator ke-1 menyala
2) Tekan secara bersamaan tombol Tengah & Atas (pada sisi kiri UPS),
selama 5 detik
3) Perhatikan indikator lampu (pada sisi kiri UPS)→off semua
4) Lepaskan UPS dari sumber listrik
2. Alat dinyalakan (parafin block dan cool block)
3. Tissue processor
a. Alat dinyalakan→Tombol on/off terdapat dibelakang alat
b. Tunggu sampai alat siap→panel monitor alat sudah menyala
c. Masukkan jaringan pada bucket yang terdapat pada chamber pertama dengan
menekan panel dengan tanda ↑↓√ↄ
d. Cek program alat (cara otomatis)
cara : 1) Tekan program
Untuk mengedit program (menambah/mengurangi waktu; menambah
program baru)→tekan ← → − +
2. Jika sudah sesuai → tekan program (untuk keluar dari program)
e. Tekan start → untuk memulai tissue processor (ditandai dengan indikator ↑↓↑
menyala)
f. Setelah proses selesai keluarkan cassette dari chamber terakhir secara
manual→dengan menekan panel dengan tanda ↑↓√ↄ
g. Posisikan cap pada chamber ke-1→dengan menekan panel dengan tanda↑↓√ↄ
Jika pada proses terakhir cap tidak dipindahkan, maka cap akan terkunci secara
otomatis,
Cara membuka kunci:
1). Tekan panel Jam→akan muncul display UW12
2). Tekan panel kunci→akan muncul display U12
3). Posisikan cap pada chamber ke-1→dengan menekan panel dengan tanda
↑↓√ↄ
4. Isi Chamber dan waktu yang diperlukan dalam tissue processor
i. Buffer Formalin→3jam
ii. Alkohol 70%→1.5jam
iii. Alkohol 80%→1.5jam
iv. Alkohol 96%→1.5jam
v. Etahnol 1 (alkohol absolut) →1jam
vi. Etahnol 2 (alkohol absolut) →1.5jam
vii. Etahnol 3 (alkohol absolut) →2jam
viii. Xylol 1→1jam
ix. Xylol 2→1.5jam
x. Xylol 3→1.5jam
 xi. Parafin 1→1.5jam
xii. Parafin 2→2jam
4. Parafin block
a. Alat dinyalakan→tekan tombol on/off yang terdapat didepan alat
b. Dibiarkan 30 menit→untuk mencairkan parafin yang terdapat dichamber alat
c. Pindahkan jaringan kedalam metal cassette dengan posisi yang sama dengan posisi
setelah pemotongan
d. Tambahkan parafin cair kedalam metal cassette
e. Tutup dengan plastic cassette
f. Tambahkan parafin cair sampai dasar plastic cassette terendam parafin cair
g. Letakkan jaringan tersebut pada cool block yang terdapat pada alat parafin block
sampai parafin mengental
 Cool block yang terdapat pada alat parafin block, mempunyai suhu
kulkas/8oC.
 Jika jaringan tersebut (yang baru dilakukan parafin block) langsung
diletakkan ada cool block (suhu freezer) akan menyebabkan retak pada
jaringan pada saat dipotong (termal shock).
5. Jaringan diletakaan di cool block
Cool block mempunyai suhu sama dengan freezer
6. Cutting
a. Letakkan jaringan yang sudah siap dipotong dengan benar pada alat
b. Lakukan proses treaming
i. kemiringan 0.5
ii. Dapat digunakan pisau yang tumpul/lama
iii. Ketebelan bervariasi
c. Jika proses treaming selesai, dan akan melakukan pemotongan jaringan
i. Ganti dengan pisau yang tajam/baru
ii. Ketebalan 0.3mm
7. Jaringan diletakkan di waterbath
Jaringan yang telah dipotong, diletakkan pada water bath
a. Water bath
1. Isi aquadest dengn penuh
2. Ditambahkan +5ml ethanol
3. Suhu water bath adalah 52oC
 b. Jaringan dibiarkan sampai mengembang dengan sempurna dalam water bath
c. Jaringan diambil dengan obyek glas yang bersih dan kering
d. Jaringan ditiriskan pada rak yang telah diberi tissue, pada suhu ruang ±30 menit
8. Jaringan diletakkan di hotplate
Jaringan yang sudah ditiriskan diletakkan pada hot plate→untuk mengurangi kadar
ethanol
a. Pada suhu hot plate 59oC→25menit
b. Pada suhu hot plate 75oC→10menit
9. Jaringan dilakukan pewarnaan (Staining)
Tahapan Pewarnaan Preparat
1) Deparafinisasi dengan xylol
a. Xylol I (3-5 menit)
b. Xylol II  (3-5 menit)
c. Xylol III  (3-5 menit)
d. Xylol IV  (3-5 menit)
2) Hidrasi dengan alkohol dengan konsentrasi menurun
a. Alkohol 100% / alkohol absolut  (3-5 menit)
b. Alkohol 96%  (3-5 menit)
c. Alkohol 80%  (3-5 menit)
d. Alkohol 70%  (3-5 menit)
3) Cuci dengan akuades  (3-5 menit)
4) Hematoxylin  (3-5 menit) (Penggunaan lama/lebih dari 50 slide7 menit)
5) Cuci dalam air mengalir  (3-5 menit)
6) Amati di bawah mikroskop, bila masih terlalu pekat warnanya, lakukan pencucian
dengan air  (3-5 menit). Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah
selanjutnya
7) Celupkan ke Bluing (3-5 menit)
8) Eosin  (3-5 menit) (Penggunaan lama/lebih dari 50 slide 7menit)
9) Dehidrasi dalam alkohol bertingkat
a. Alkohol 70%  (3-5 menit)
b. Alkohol 80%  (3-5 menit)
c. Alkohol 96%  (3-5 menit)
 d. Alkohol 100% / alkohol absolut  (3-5 menit)
10) Jernihkan ( clearing ) dengan xylol
a. Xylol I  (3-5 menit)
b. Xylol II  (3-5 menit)
c. Xylol III  (3-5 menit)
d. Xylol IV  (3-5 menit)
10. Jaringan dilakukan pelekatan (Mounting)
Proses mounting yaitu memberikan entelan di atas objek glass dan ditutup dengan
cover glass. ( saat di tetesi entelan/ Canada balsam, preparat tidak boleh kering dari
xylol). Objek glass yang telah diberikan entelan kemudian ditutup dengan cover glass,
dan diamati di bawah mikroskop.

GAMBAR

a b c

d e f
 g h i

j k l

m n o

p q r

Keterangan Gambar :

a. Pembiusan mencit dengan chloroform

b. Pembedahan
c. Isolasi jaringan tubuh mencit dalam NaCl 0,9%
d. Tissue Automatics Processor
e. Metal cassete
f. Proses blocking pada paraffin block
g. Proses pembekuan blok preparat pada cool block
h. Blok preparat
i. Mikrotom, waterbath dan lampu
j. Proses pemotongan blok preparat (cutting)
k. Hasil potongan pada mikortom diletakkan pada waterbath agar jaringan mengembang
l. Pemilihan paraffin yang berisi jaringan
m. Pengambilan jaringan yang telah dipotong dengan obyek glass
n. Obyek glass yang berisi jaringan diletakkan diatas hotplate
o. Larutan dan zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
p. Proses pewarnaan preparat
q. Proses mounting (pemberian etelan pada preparat dan ditutup dengan cover glass)
r. Preparat yang sudah jadi