3.

2 Metode Aseptis dan Sterilisasi

Metode Aseptis
metode aseptis merupakan suatu teknik pemindahan atau transfer kultur bakteria dari suatu
tempat ketempat yang lain secara steril (aseptis) agar tidak terkontaminasi oleh mikroba
cara peminadahan kultur mikroba secara aseptis:
1. Seluruh material dan media yang akan digunakan langsung dan berhubungan dengan
mikroba harus di sterilkan terlebih dahulu
2. Area tempat bekerja harus dijaga agar tidak terkontaminasi dengan mikroba yang
digunakan
3. Gunakan ose yang sudah steril untuk menyentuh dan mengambil mikroba, hal ini
bertujuan agar tidak terjadinya kontaminasi, kemudian ose yang telah selesai digunakan
harus di sterilkan kembali.
4. Panaskan mulut tabung dengan baik pada saat ose hendak dimasukkan dan dikeluarkan
dari tabung, hal ini bertujuan agar tidak terkontaminasi dari bakteri yang berasal dari luar
yang membawa partikel atau debu ke dalam tabung, dan membakar sel sel yang jatuh
maupun menempel pada mulut tabung pada saat ose dimasukkan dan dikeluarkan
5. Tabung tidak boleh terbuka lama, usahakan kondisi tabung terbuka dalam waktu
sesingkat singkatnya
6. Tutup tabung harus steril, hindari pada permukaan area kerja yang tidak steril, dan
usahakan tidak boleh disentuh.

Sterilisasi
Sterilisasi bertujuan untuk membebaskan semua alat dan bahan dari bentuk kehidupan, proses
sterilisasi mematikan atau menghilangkan organisme yang terdapat pada suatu benda, seperti
menghilangkan mikroba yang sebelumnya mengkontaminasi alat-alat dan bahan bahan
laboratorium.
Sterilisasi harus dilakukan terlebih dahulu agar menghilangkan / membunuh organisme maupun
mikroorganisme yang berpotensi mengkontaminasi alat alat dan bahan bahan laboratorium
Ada beberapa mrtode sterilisasi diantaranya:
a. Sterilisasi Mekanik : Sterilisasi Dengan Membrane Filter
Bahan-bahan yang tidak boleh dipanaskan, seperti serum dan beberapa macam gula
tertentu dapat disterilkan dengan menggunakan membran filter. Dalam bidang
mikrobiologi, alat penyaring yang paling banyak dipergunakan adalah filter berkerfield,
filter chamberland, filter seilz, dan lain-lain. Filter-filter ini terbuat dari polimer khusus
dengan diameter 0,45 mikron, sehingga dapat menahan bakteri yang terkandung dalam
sampel.
Alat dan bahan :
a. Polisulfon membran dengan diameter 0,22 mikron (hidrofilik)
b. Satu set alat percobaan membran lengkap dengan regulator gas.
c. Cawan petri
d. Botol McCartney
e. Gun pipet lengkap dengan tipsnya
f. Medium NA tegak
g. Saliva

Cara kerja :
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 derajat celcius
b. Saringlah sejumlah saliva dengan menggunakan membran polisulfon.
c. Pipet sebanyak 1 ml. Saliva hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri
d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml saliva yang tidak disaring dan tempatkan pada cawan petri
kedua.
e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam masing-
masing cawan petri yang sudah berisi sampel saliva.
f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen dengan
medium, dan biarkan membeku.
g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam

b. Sterilisasi fisik
1. Sterilisasi dengan pemanasan
 Pemanasan dengan udara kering atau udara basah Cara ini sangat cocok untuk
mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan yang tahan panas. Dalam cara ini, temperatur
yang dipakai adalah 170 derajat celcius dan dilakukan selama 1 jam.
 Tindalisasi Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan suhu
tinggi. Dalam cara ini, bahan dan alat dipanaskan selama 30 menit pada suhu 100
derajat celcius, dan diulang sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1
hari. Bahan dan alat disimpan pada suhu kamar pada saat tidak dipanaskan.
 Pasteurisasi Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang akan
mengalami denaturasi pada suhu tinggi. Dengan cara ini, alat dan bahan dipanaskan
pada suhu 60 - 80 derajat celcius selama satu jam sebanyak 3 kali berturut-turut,
dengan selang waktu 1 hari.
 Sterilisasi dengan nyala api langsung. Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan
jarum inokulasi (ose). Cara kerja: - Nyalakan lampu spiritus - Ambil ose dan bakar
ujung ose dengan api lampu spiritus sampai berpijar (warna biru)
 Sterilisasi dengan uap panas yang bertekanan Cara ini umum dipakai untuk
mensterilkan alat dan bahan yang tahan panas tinggi dan tekanan. Alat yang dipakai
adalah autoclave yang dapat mencapai suhu 120 derajat celcius dan tekanan 15 lbs.

2. Sterilisasi dengan radiasi

 Sterilisasi dengan Autoclave Elektrik
Dalam praktikum ini akan dilakukan sterilisasi alat terbuat dari kaca dan medium padat
dengan menggunakan autoclave elektrik. alat-alat dan bahan yang akan disterilkan
dengan cara membungkus alatalat tersebut dengan menggunakan alumium foil atau
kertas setelah alat-alat tersebut dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan
Alat : - Autoklaf listrik
Glass ware (cawan petri, tabung reaksi, erlemayer)
Bahan :
Aquadest - Kapas - Kertas - Plastik PE – Karet

Cara Kerja :
a. Persiapan peralatan dari gelas (glass ware) yang akan disterilisasi
1. Siapkan alat gelas (tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri) yang sudah dicuci bersih
dan dikeringkan .
2. Buatlah penutup dari kapas steril untuk tabung reaksi dan erlenmeyer. Pastikan kapas
penutup tergulung sempurna dan tidak mudah rusak saat penutup dibuka. Kapas
penutup harus bisa menutup alat gelas hingga tidak ada udara yang bisa masuk.
Bungkus kapas penutup dengan kertas kedap air.
3. Bungkus cawan petri dengan kertas kedap air dan pastikan posisinya dibalik agar
tidak ada uap air yang masuk selama sterilisasi.
4. Bungkus semua alat dengan plastik PE dan pastikan tidak ada udara yang ada dalam
platik kemudian ikatlah plastik dengan karet dan masukkan ke dalam keranjang
autoklaf.

Cara menggunakan autoclave

1. Letakkan Autoclave Hirayama HVE 50 pada permukaan yang stabil dan rata dan
hindarkan dari sinar matahari secara langsung.
2. Hubungkan stop kontak dengan sumber tenaga listrik.
3. Tekan tombol “ON” yang ada di sisi kanan.
4. 4.Tekan POWER ON/OFF untuk menghidupkan dan mematikan mesin autoclave
5. Sebelum melakukan sterilisasi, periksa terlebih dahulu larutan aquadest dalam
autoclave (2 liter) dengan cara menggeser tuas yang ada pada autoclave ke arah
open. Jika air dari batas yang ditentukan kurang, maka dapat ditambah air sampai
batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi/steril untuk menghindari terbentuknya
kerak dan karat.
6. Masukkan alat yang telah dibungkus dengan aluminium foil (boleh kertas bekas)
dan bahan yang akan disterilkan ke dalam chamber
7. Tekan bagian depan-tengah tutupnya sampai magnet catch tertarik ke magnet.
Sambil menekan tutup, geser tuas open/close ke sisi LOCK.
8. Pilih Mode (Process). Mode Aplikasi :
- LIQ Sterilisasi medium agar (dihangatkan untuk pencegahan koagulasi setelah
sterilisasi).
- LIQ Sterilisasi cairan, seperti air, media, reagen, dan obat-obatan cair, yang
bertahan pada suhu tinggi, uap bertekanan tinggi.
 - SOLID Sterilisasi alat dari kaca, logam keramik, atau karet yang tahan terhadap
suhu tinggi, uap tekanan tinggi dan penurunan tekanan uap secara tiba-tiba selama
proses pembuangan.
9. ubah nilai set.
a. Tekan tombol SET/ENT.
b. Tekan tombol NEXT untuk memilih item untuk mengubah.
c. Ubah nilai ditampilkan menggunakan tombol increase/decrese (↑,↓).
d. Tekan tombol SET/ENT. Untuk membatalkan perubahan pengaturan selama
perubahan operasi, tekan tombol MODE. Nilai-nilai yang berubah tidak akan
disimpan dan peralatan akan kembali ke keadaan siap (stabdby)
10. Untuk memulai operasi tekan tombol START/STOP
11. Tunggu sampai proses sterilisasi selesai, Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka
tunggu tekanan turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum
pada preisure gauge/penunjuk tekanan menunjuk ke angka 0). Kemudian tutup
dibuka dan keluarkan isinya dengan hati-hati, tutup kembali setelah semua barang
dikeluarkan.
12. Matikan mesin autoclave dengan cara menekan tombol “OFF” yang ada di sisi
kanan, cabut kabel stop kontak dan simpan mesin autoclave di tempat yang
kering.

 Sterilisasi dengan sinar UV

Alat dan bahan:
a. Cawan petri
b. Medium Agar tegak.
c. Lampu UV
d. Lampu Bunsen

Cara kerja:
a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.
b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.
c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3
menit, dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).
d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 derajat celcius, dalam
keadaan terbalik.

c. sterilisasi dengan zat kimia

1. sterlisasi dengan alcohol
Alat dan bahan:
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Jarum pentul/Paku kecil.
d. Alkohol dengan konsentrasi 40 %, 70 %, dan 100 %
e. Air steril (Akuades)
f. Pinset

Prosedur Kerja:
A. Persiapan :
Buat pengenceran alcohol dengan menggunakan rumus : C1.V1=C2.V2 Ket : C1 =
Konsentrasi bahan awal (alcohol 100%) V1 = Volume bahan awal yang harus diambil C2 =
Konsentrasi bahan yang ingin dibuat/diencerkan V2 = Volume bahan yang ingin
dibuat/diencerkan Contoh : Untuk membuat konsentrasi alcohol 40% 100%.V1=40%.250 ml
V1 = 10000:9100 V1 = 100 ml Jumlah Pelarut (Akuades) yang harus ditambahkan : V2-V1
250 ml – 100 ml = 150 ml Ambil Alkohol 96% sebanyak 100 ml, lalu tambahkan akuades
sebanyak 150 ml, sehingga diperoleh Alkohol 40%.

B. Cara Kerja:
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan
membeku pada suku kamar.
b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.
c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam cawan
petri.
d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Konsentrasi alkohol mana
yang paling efektif untuk sterilisasi

2. Sterilisasi dengan Sabun

Alat dan bahan:
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Sabun.

Cara kerja:
a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua
cawan petri steril
b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan
petri pertama.
c. Cuci jari tangan sebersih mungkin dan biarkan kering dengan sendirinya (jangan di
keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan jari pada permukaan medium dalam cawan
petri kedua.
d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 derajat celcius.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.