1.

Siapkan suspensi sel (atau bubuk sel beku) seperti yang dijelaskan pada Langkah 1 Bab 6, Protokol
1.

2. Buka sel dengan salah satu dari dua metode berikut.

Untuk lisis sel dari jaringan

Sebuah. Tambahkan bubuk sel beku sedikit demi sedikit ke sekitar. 7,5 volume larutan lisis sel dalam
gelas kimia. Biarkan bubuk menyebar di permukaan larutan lisis, dan kemudian kocok gelas untuk
merendam bahan.

b. Ketika semua material ada dalam larutan, pindahkan larutan ke tabung centrifuge.

3. Tutup tabung dan inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar pada platform goyang.

4. Keluarkan 18 ml etanol pada suhu kamar ke dalam masing-masing dari serangkaian tabung
centrifuge polypropylene 50-ml sekali pakai. Gunakan pipet lebar untuk melapisi suspensi sel dengan
hati-hati di bawah etanol.

5. Pulihkan DNA dari setiap tabung dengan perlahan-lahan mengaduk antarmuka antara sel lisat dan
etanol dengan penjahat Shepherd. DNA akan menempel pada penjahat, membentuk massa agar-
agar. Lanjutkan mengaduk sampai etanol dan fasa air tercampur rata.

6. Pindahkan masing-masing bajingan Shepherd, dengan DNA yang melekat padanya, ke tabung
polipropilena terpisah yang mengandung 5 ml etanol pada suhu kamar. Biarkan DNA terendam
dalam etanol sampai semua sampel telah diproses.

7. Lepaskan setiap penjahat, dengan DNA yang melekat, dan biarkan etanol sebanyak mungkin
mengalir. Pada tahap ini, DNA seharusnya menyusut menjadi massa yang padat dan dehidrasi; maka
dimungkinkan untuk menghilangkan sebagian besar etanol bebas dengan aksi kapiler dengan
menyentuh ujung berbentuk U dari penjepit ke setumpukan Kimwipes. Sebelum semua etanol
menguap dari DNA, pindahkan bajingan ke dalam tabung polipropilen segar yang mengandung 5 ml
etanol pada suhu kamar.

8. Ketika semua sampel telah diproses, sekali lagi keluarkan etanol sebanyak mungkin (lihat Langkah
7). Jangan biarkan pelet DNA mengering sepenuhnya atau mereka akan sangat sulit larut.

9. Pindahkan setiap pipet ke tabung polipropilen segar yang mengandung 1 ml TE (pH 8.0). Biarkan
DNA mengalami rehidrasi dengan menyimpan tabung semalaman pada suhu 4 ° C.

10. Selama rehidrasi, DNA menjadi sangat agar-agar tetapi tetap melekat pada pipet mereka.
Gunakan penjahat Shepherd segar sebagai pencakar untuk membebaskan pellet DNA dengan
lembut dari pipet mereka. Buang pipet, biarkan pelet DNA mengambang di TE. Tutup tabung dan
inkubasi pada suhu 4 ° C pada platform goyang sampai pelet benar-benar larut (sekitar 24-48 jam).
Tingkat kontaminasi oleh RNA dijaga dalam batas yang dapat diterima jika 1,5 ml atau lebih larutan
lisis digunakan per 107 sel. Namun, jumlah RNA yang mengkontaminasi sampel DNA dapat dikurangi
lebih lanjut dengan menambahkan RNase (konsentrasi akhir 1 μg / ml) ke dalam larutan DNA.

11. Analisis alikuot dengan elektroforesis gel medan-pulsed (Bab 5, Protokol 17 atau Bab 5, Protokol
18) atau dengan elektroforesis melalui gel agarosa 0,6% (Bab 5, Protokol 1). Simpan DNA pada suhu
4 ° C. DNA harus kira-kira. Berukuran 80 kb dan harus bermigrasi lebih lambat dari monomer DNA
bakteriofag. Karena DNA yang dibuat oleh prosedur ini selalu terkontaminasi dengan sejumlah kecil
RNA, perlu untuk memperkirakan konsentrasi DNA dalam persiapan akhir baik dengan fluorometry
atau dengan elektroforesis gel dan pewarnaan dengan etidium bromida (Bab 5, Protokol 2).