Wholemount

Embrio Ayam
Nama : Patima Sari Harahap
Nim : 4183341039
Kelas : Biologi Dik E 2018
Wholemount merupakan
sediaan mikroteknik
keseluruhan dari suatu
objek yang diamati.
Embrio ayam merupakan
salah satu model tepat
untuk teknik wholemount.
 Tahapan Wholemount Embrio Ayam

1. Tahap Persiapan

Pada tahap ini terlebih dahulu ditentukan umur embrio ayam yang
diinginkan yang sebaiknya berumur 24 jam, 33 jam, dan 48 jam. Objek
yang digunakan untuk sediaan, dalam hal ini embrio ayam terlebih dahulu
diinkubasi di dalam dalam inkubator pada suhu 39oC atau 103oF. Umur
embrio ditentukan mulai jam ke-0 setelah telur dikeluarkan oleh induk.
Pada tahap ini juga dilakukan pembuatan larutan yang dibutuhkan untuk
pembuatan preparat.

2. Fiksasi

Proses selanjutnya dlanjutkan dengan fiksasi dengan pikro-sulfat atau

larrutan Bouin selama 6 sampai 24 jam. Selanjutnya larutan fiksatif
tersebut dihilangkan dengan alcohol 70% hingga warna larutan fiksatif
hilang.
 3. Rehidrasi
Sebelum dilakukan pewarnaan terhadap
embrio, sebelumnya dilakukan perendaman
terlebih dahulu dengan menggunakan larutan
alkohol 50%, 30% masing- masing 0,5 jam,
kemudian dilanjutkan dengan perendaman
dengan larutan aquades selama 0,5 jam.
Perendaman ini bertujuan untuk proses
rehidrasi sel-sel embrio ayam.
5. Pewarnaan
Pewarnaan terhadap embrio ayam menggunakan hematoxylin delafield
selama 1 malam.
4. Dehidrasi
Selanjutnya setelah pewarnaan maka dilanjutkan
dengan dehidrasii untuk menampakkan anatomi
tubuh embrio lebih jelas. Dalam pembuatan
sediaan embrio ayam ini, proses dehidrasi
dilakukan dengan menggunakan alkohol 70%-
asam. Setelah pencucian, proses selanjutnya yaitu
dehidrasi dengan konsentrasi yang lebih tinggi.
Dalam pembuatan sediaan embrio ayam
menggunakan 4 tingkatan konsentrasi yaitu 50%,
70%, 95% dan 100%, masing- masing selama 10-
15 menit.
 Setelah proses dehidrasi selesai maka dilakukan
6. Clearing proses penjernihan. Sebelumnya kita perlu
7. kertas saring yang
melepaskan terlebih dari
meekat pada embrio baru kemudian dilakukan
penjernihan.

7. Mounting

Adapun proses terakhir setelah penjernihan yaitu proses mounting. Mounting ialah
meletakkan zat perekat di antara kaca benda dan kaca penutup sehingga obyek atau
irisan tnggal tetap, permanen di dalamnya dan dalam keadaan transparan, untuk
pemeriksaan di bawah mikroskop. Zat perekat (mounting media/ mountant) yang
digunakan adalah jenis zat perekat yang daat bercampur dengan air yaitu balsam.
 Wholemount Nematod
1 Fiksasi
 Tahap fiksasi ini memastikan akses cepat
fiksatif ke dalam jaringan bagian dalam,
sehingga dapat mengatasi hambatan
pelindung kutikula kolagen-lipid.
 Prinsip awal ini digunakan di sini dalam
modifikasi yang diusulkan, dengan 4%
formalin atau trietanolamina formalin (TAF) (2
ml trietanolamina, 10 ml 40% untuk malin, dan
air suling ditambahkan ke volume akhir 100
ml). Pemrosesan
Pemrosesan nematoda tetap sampai
2 gliserol terkonsentrasi:
Dianjurkan untuk memulai persiapan slide dari suspensi
nematoda yang dipanaskan dan dipanaskan sebelumnya
hanya setelah mencapai suhu kamar (15-258C). Untuk hasil
terbaik, sebaiknya simpan nematoda dalam fiksatif minimal
selama 48 jam atau lebih. Larutan terberat dalam berat jenis
adalah gliserol anhidrat, yang paling mengapung adalah air
itu sendiri, dan larutan airgliserol dapat diencerkan di
antaranya tergantung pada kandungan gliserol. Jika kita
menambahkan gliserol pekat langsung ke nematoda tetap,
struktur tubuh akan rusak permanen. Oleh karena itu,
saturasi nematoda dengan gliserol harus lambat dan
bertahap, dan kolom bertingkat dari `` koktail '' gliserol
adalah alat terbaik untuk mencapai hal ini
 Wholemount Nematod
Persiapan slide suspensi
3 untuk tujuan ekologi
Cincin lilin dilepas dengan hati-hati dari kaca geser dengan menggunakan
pisau bedah. Gliserol anhidrat kemudian ditambahkan hingga menutupi
semua nematoda secara merata pada area yang identik dengan kaca
penutup 24 - 24 mm. Sebuah slide dipanaskan 10 menit pada hot plate yang
diatur untuk 858C untuk menghilangkan sisa air dan mempercepat infus
gliserol ke dalam badan nematoda.

Persiapan koleksi slide

4 standar

Slide dipanaskan pada hot plate (858C) selama 10 menit untuk menghilangkan
sisa air, untuk mempercepat infus gliserol ke dalam badan nematoda, dan
untuk menghilangkan sedikit deformasi nematoda Untuk nematoda dengan
diameter tubuh lebih dari 40 mm, disarankan untuk menambahkan penyangga
penutup kaca dengan diameter proporsional (batang kaca, serat nilon, dan
manik-manik) di dekat dua titik lilin sebelum memasang kaca penutup.
5 Usia koleksi slide

Kualitas morfologi nematoda sangat tergantung pada durasi prosedur fiksasi.

Fiksasi 2 jam memungkinkan kualitas morfologi yang baik. Namun, pada
spesimen nematoda yang difiksasi selama dua hari atau lebih, jaringan bagian
dalam yang mengeras yang dihasilkan memberikan kualitas morfologi yang
lebih baik. Risiko lain adalah ketika spesimen menjadi rata selama masa pakai
slide yang lama. Ini dapat terjadi jika parafin tanpa lilin lebah digunakan sebagai
penyegel
 Wholemount Embrio Tikus
1. Dapatkan Embrio
2. Tempatkan embrio dalam 5 ml bijous dalam 4% paraformaldehyde. Biarkan
untuk memperbaiki 4 Hai C. Waktu yang dibutuhkan membutuhkan
pengoptimalan. Kami menyarankan untuk mencoba antara 2 jam dan semalam.

3. Cuci 3X dalam PBS 0,5 - 1% Triton tiga puluh menit setiap kali.
4. Inkubasi embrio dua kali selama 1 jam dalam blok (PBS 1% Triton + 10% FCS
+ 0,2% SodiumAzide), suhu kamar.
5. Inkubasi embrio dalam blok peroksidase (0,1% H. 2 HAI 2 diencerkan dalam
buffer pemblokiran) semalaman 4 Hai C.
6. Cuci embrio 2X di buffer blocking.
7. Pindahkan embrio menggunakan pipet pasteur dengan ujung dipotong menjadi
tabung 2 ml. Tambahkan antibodi primer pada pengenceran / konsentrasi yang
diperlukan.
8. Inkubasi selama 1 sampai 4 hari dengan rotasi lembut pada 4 Hai C. Waktu
inkubasi ini akan membutuhkan beberapa optimasi tergantung pada antibodi dan
juga ukuran embrio.
 Wholemount Embrio Tikus
9. Cuci embrio 3X 1 jam dalam PBS 1% Triton + 10% FCS 0,2% natrium azida
10. Cuci 3X 10 menit dalam PBS 1% Triton Cuci bersih untuk menghilangkan sisa
natrium azida karena ini akan menghambat aktivitas peroksidase saat berkembang
11. Tambahkan antibodi sekunder dalam buffer pemblokiran (tanpa natrium azida)
12. Induksi selama 2 sampai 4 hari dengan rotasi lembut 4 Hai C
13. Cuci 3X 10 menit dalam PBS 1% triton
14. Inkubasikan embrio dalam substrat DAB selama 2 sampai 3 jam RT.
15. Pindahkan embrio ke piring dan tambahkan DAB segar ditambah 5 µl H. 2 HAI 2 per
1 ml DAB.
16. Bilas tiga kali dalam PBS setelah reaksi dan pewarnaan mencapai intensitas yang
diinginkan
17. Mount dan lihat embrio. Simpan pada suhu 4 derajat hingga sampel dianalisis
 Wholemount Embrio Tikus
1. Tempatkan sampel dalam 100% gliserol selama 48 jam. Ketika sampel
sepenuhnya disetimbangkan dengan gliserol (yaitu tercampur sempurna
dengan gliserol), sampel akan tenggelam ke dasar botol. Pastikan sampel
berada pada tahap ini sebelum melanjutkan.
2. 75% gliserol memiliki kepadatan yang kira-kira sama dengan gelatin
yang digunakan untuk memasang dan mengatur sampel pada slide. Oleh
karena itu, sampel harus disetimbangkan dalam 75% gliserol setelah
pewarnaan selama kurang lebih 15 menit (sekali lagi, ketika
disetimbangkan, sampel harus tenggelam).
3. Masukkan 50% gliserol sampai sampel tenggelam. Embrio dapat
dicitrakan pada tahap ini, atau dipasang seluruhnya di gliserol pada slide.
Gunakan minyak di sekitar tepi penutup kaca untuk perlindungan. Biarkan
selama sekitar 30 menit untuk menyeimbangkan sebelum mengambil
sampel untuk dipasang. Saat diimbangi dengan gelatin, sampel harus
tenggelam ke dasar.
Thanks !