Metode : Amobilisasi Enzim Adsorpsi

Jenis Enzim: Pektinase

Jenis Substrat: Kitosan
Kitosan sebagai media amobilisasi enzim dapat diubah strukturnya oleh adanya senyawa
pengikat silang . Salah satu agen pengikat silang adalah natrium tripolifosfat . Dengan
penambahan natrium tripolifosfat, ukuran pori dan porositas kitosan dapat berubah , sehingga
akan mempengaruhi jumlah enzim yang tertahan pada matriks
Perlakuan : Amobilisasi enzim dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml larutan enzim
hasil pemurnian pada berbagai perlakuan kitosan (1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0)% sebanyak 4 mL.
Larutan campuran masing-masing dimasukkan ke dalam syringe dan ditekan sehingga
campuran menetes ke dalam wadah berisi 10 mL larutan natrium tripolifosfat 3%. Manik-
manik yang terbentuk dibiarkan terendam dalam larutan natrium tripolifosfat 3% selama 75
menit. Enzim amobil dengan larutan dipisahkan melalui penyaringan. Filtrat yang didapat
diuji kadar protein sisanya dan pektinase amobil yang didapat diuji aktivitasnya
Pengamatan: Pektinase yang diamobilkan akan terjebak dalam kitosan yang berikatan silang
dengan natrium tripolifosfat. Kitosan yang dilarutkan dalam asam asetat akan mengalami
protonasi pada gugus aminanya menjadi -NH3 + . Peningkatan konsentrasi kitosan yang
digunakan untuk amobilisasi pektinase akan meningkatkan jumlah pektinase terjebak . Pada
konsentrasi kitosan 3%, jumlah pektinase yang terjebak paling banyak yaitu sebesar 3,652
mg/mL. Semakin besar konsentrasi kitosan maka ikatan silang yang terbentuk juga semakin
banyak, akibatnya pori yang dihasilkan juga semakin rapat. Kerapatan pori ini akan
mencegah pektinase yang terjebak untuk lepas kembali selama proses amobilisasi, selain itu
kerapatan pori mempengaruhi kemampuan sisi aktif pektinase untuk bergerak bebas dan
berikatan dengan substrat.
Hasil Pengamatan: Aktivitas amobilisasi pektinase dalam matriks kitosan-
NatirumTripolifosfat sebesar 49, 6 Unit dan Efisiensi pemakaian ulang pektinase pada sistem
amobil dengan matriks kitosan-natrium tripolifosfat dapat dilakukan sampai lima kali
pengulangan dengan aktifitas terakhir 54.03%
Sumber Pustaka: Prasetyawan,s (2015) OPTIMASI AMOBILISASI ENZIM PEKTINASE
DARI ASPERGILLUS NIGER MENGGUNAKAN MATRIKS KITOSAN –NATRIUM
TRIPOLIFOSFAT DAN PENENTUAN EFISISENSI PENGGUNAANNYA. Prosiding
SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat Universitas Tanjungpura, Pontianak
Metode : Amobilisasi Enzim Cross-Linking
Jenis Enzim : Bromelin
Jenis Substrat : Kasein dengan bantuan Kitosan
Kitosan dapat mempengaruhi jumlah enzim yang teramobil.
Perlakuan : Amobilisasi bromelin dilakukan dengan variasi pada Kitosan mulai dari 50, 100,
150, 200 dan 250 mg. Enzim Bromelin sebanyak 50 mg dimasukkan ke dalam 3,6 mL
Larutan buffer fosfat pH 6 dan ditambahkan kitosan dengan lima variasi, kemudian
didiamkan selama 15 menit dalam lemari es. Campuran ditambahkan 0,4 mL Glutaraldehid
5% dan didiamkan 30 menit pada suhu ruang. Campuran disimpan dalam lemari es selama 18
jam. Enzim amobil yang terbentuk disaring dan dicuci dengan 30 mL aquades. Filtrat air
cucian enzim diencerkan hingga 50 mL dan ditentukan kandungan proteinnya (jumlah enzim
yang tidak teramobil). Selanjutnya, enzim amobil diambil 10 mg setiap variasi dan diuji
aktivitasnya dengan substrat kasein 3000 ppm.
Enzim bromelin yang ditambahkan mulai dari 10, 30, 50, 70 dan 90 mg. Setelah enzim
amobil terbentuk, kemudian disaring dan dicuci dengan larutan 30 mL aquades. Filtrat air
cucian Enzim diencerkan hingga 50 mL dan ditentukan kandungan proteinnya (jumlah enzim
yang tidak Teramobil). Kemudian enzim amobil diambil 10 mg setiap variasi dan diuji
aktivitasnya dengan substrat Kasein 3000 ppm.
Enzim bromelin yang telah diamobilisasi ditentukan aktivitasnya terhadap pengaruh
konsentrasi substrat. Substrat kasein yang ditambahkan yaitu dari 1000, 2000 dan 3000 ppm
dan diambil masing-masing sebanyak 10 mL. Enzim bromelin amobil 10 mg dimasukkan ke
dalam larutan substrat dan dihomogenkan dengan shaker kecepatan 120 rpm pada suhu ruang
selama 2 jam. Enzim bromelin amobil dipisahkan dari larutan substrat. Filtrat yang telah
dipisahkan ditentukan kadar protein menggunakan metode biuret.
Pengamatan : Enzim akan berikatan silang dengan matriks pendukung kitosan yang
diaktifkan oleh pereaksi Cross linking yaitu glutaraldehid. Gugus aldehid pada Glutaraldehid
akan berikatan dengan gugus amina pada Kitosan dan gugus amino pada enzim, sehingga
membentuk formasi kitosan-glutaraldehid-enzim. Kitosan dilakukan lima variasi dengan
penambahan jumlah enzim yang sama besar yaitu 50 mg. Dengan dilakukannya variasi
tersebut, dapat diketahui pengaruh konsentrasi kitosan terhadap jumlah enzim yang
teramobil. Semakin banyak kitosan yang diberikan maka semakin meningkat jumlah enzim
yang teramobil. Jumlah enzim yang teramobil tersebut merupakan enzim terdapat dalam
massa total (dengan matriks kitosan) yang diperoleh, dimana semakin banyak kitosan maka
massa total enzim amobil diperoleh semakin besar. Untuk itu pengukuran aktivitas enzim
dilakukan dengan menggunakan massa enzim amobil yang sama besar.
Hasil Pengamatan : Konsentrasi kitosan dan konsentrasi bromelin berpengaruh terhadap
jumlah enzim yang teramobil serta aktivitasnya. Kondisi optimum dari variabel yang
dilakukan pada amobilisasi enzim Bromelin didapatkan pada konsentrasi kitosan 250,4 mg
dan konsentrasi enzim 10 mg dengan total enzim teramobil 9,5417 mg dan aktivitas enzim
dalam 10 mg Enzim amobil sebesar 86,2067 Unit. Uji aktivitas enzim amobil maksimum
pada konsentrasi substrat 3000 ppm dan perulangan penggunaan enzim amobil dapat
digunakan hingga enam kali dengan efisiensi 57,69%.
Sumber Pustaka : Sya’bana, M & Nawfa, R.(2016).Optimasi Amobilisasi Bromelin
Menggunakan Matriks Pendukung Kitosan. JURNAL SAINS DAN SENI ITS, 5(2), 117-121.
Metode : Amobilisasi Enzim Kovalen
Jenis Enzim : Lipase
Jenis Substrat : kitosan
Perlakuan :Padatan enzim sebanyak 1 mg terlebih dahulu dilarutkan dalam 1 Ml bufer K-
fosfat 50 mM pH 8, untuk memperluas area kontak enzim dengan matriks. Dalam tabung
terpisah, sebanyak 10 mg KMK disuspensikan dalam 2 mL pelarut (isopropanol atau
kloroform). Ke dalam suspensi KMK kemudian ditambahkan larutan enzim. Campuran
matriks-enzim diaduk pada 20 oC selama 12 jam. Setelah reaksi berakhir, larutan
disentrifugasi pada 3800 × g selama 30 menit. Enzim terikat matriks terdapat di bagian pelet,
yang selanjutnya dibilas dengan 3 × 5 mL bufer K-fosfat 50 mM pH 8 dan disimpan pada
suhu 4 oC.
Sebanyak 500 µL sampel direaksikan dengan 500 µL reagen Bradford kit pada suhu ruang.
Reaksi dibiarkan berlangsung selama sepuluh menit. Produk hasil reaksi diukur pada panjang
gelombang 595 nm. Absorbansi sampel kemudian dibandingkan dengan kurva standar
Bovine Serum Albumin. Kadar protein terikat matriks ditentukan dari selisih enzim mulamula
dengan enzim yang terukur di supernatan
Campuran substrat dibuat dengan mencampurkan larutan substrat p-nitrofenil dekanoat 10
mM (dalam asetonitril), etanol, dan bufer glisin-NaOH 50 mM pH 9 dengan perbandingan
1:4:95. Campuran substrat dibuat segar sebelum dilakukan uji aktivitas. Sebanyak 90 µL
campuran substrat ditempatkan dalam tabung mikro dan diinkubasi selama 30 detik. Kedalam
tabung mikro ditambahkan 1mg enzim amobil kemudian campuran akhir diinkubasi selama
90 detik. Reaksi dihentikan dengan inkubasi campuran enzim-substrat dalam es. Uji aktivitas
dilakukan pada 50 oC dan pH 9. Produk hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 405 nm.
Selisih dari absorbansi kemudian dibandingkan dengan kurva standar p-nitrofenol untuk
menentukan aktivitas enzim.
Pengamatan : Proses amobilisasi secara kovalen menghasilkan ikatan yang kuat antara
matriks dan enzim, namun lokasi pengikatan yang berada di sekitar sisi aktif enzim dapat
mengganggu aktivitas enzim. Interaksi matriks KMK dengan enzim diduga berasal dari
gugus karboksimetil yang bersifat asam dengan residu-residu asam amino basa dalam enzim,
seperti lisin dan arginin. Hasil pemetaan residu-residu lisin dan arginin dalam enzim lipase
Geobacillus thermoleovorans PPD2 menunjukkan adanya residu di bagian lid, yang dapat
berakibat fatal jika terikat ke matriks.
Hasil Pengamatan : Sistem amobilisasi menggunakan matriks karboksimetil kitosan (KMK)
berhasil diterapkan untuk mengamobilisasi enzim lipase. Matriks KMK terikat secara
kovalen dengan residu-residu asam amino basa yang tersebar di permukaan enzim, dengan
beberapa residu diantaranya berada di dekat lid sehingga terjadi penurunan aktivitas enzim
amobil. Amobilisasi lipase pada matriks KMK dalam pelarut isopropanol memberikan hasil
yang lebih baik dari segi pengikatan protein maupun aktivitas enzim amobil yang dihasilkan.
Sumber Pustaka : Permana, A, H & Yuliana, E.(2020).Pembuatan Matriks Karboksimetil
Kitoson Untuk Amobilisasi Enzim Lipase. Jurnal Warta Akab 44 (1), 20-25