Percobaan kali ini yaitu isolasi papain dari pepaya. Percobaan ini bertujuan untuk
memisahkan enzim dari tempatnya semula yakni di dalam sel. Enzim yang diisolasi ialah enzim
papain. Enzim papain merupakan enzim protease yang terkandung dalam getah papaya, baik
dalam buah, batang, maupun daunnya. Dalam percobaan ini, diambil getah papaya dari kulit
buahnya. Waktu yang tepat untuk pengambilan getah papaya yaitu pagi hari sebelum matahari
terbit, dan sore hari sebelum matahari terbenam. Proses pengambilan ialah dengan menorah kulit
buah secara vertical dengan menggunakan pecahan kaca, penorehan diusahakn tidak terlalu
dalam agar getah dapat keluar.
Proses selanjutnya setelah didapat getah papaya, dapat dilakukan isolasi enzim.
Prosesisolasi secara garis besar dapat terbagi menjadi 3 tahap, yaitu ekstraksi padat-cair,
sentrifugasi dan presipitasi. Pada tahapan ekstraksi padat-cair diawali dengan pengenceran getah
papaya dengan aquades, penambahan aquades ini bertujuan untuk terjadinya hidrolisis air dengan
getah papaya, pada protein ikatan peptide akan terputus dan akan terurai menjadi molekul lebih
sederhana. Reaksi hidrolisis papain dengan air adalah sebagai berikut:
Untuk pengujian aktivitas enzim, dilakukan metode Murachi yaitu penentuan konsentrasi
produk dari reaksi enzim papain dengan menggunakan substrat kasein 2%. Jumlah enzim yang
berikatan dengan substrat dapat dilihat dari kenaikan nilai absorbansi pada saat pengukuran
dengan spektrofotometer. Untuk mereaksikan enzim dengan substrat digunakan larutan L-sistein
sebagai activator yang akan mempercepat pengikatan substrat dengan enzim. Kemudian
diinkubasi selama 20 menit agar proses interaksi antara enzim dengan substrat dapat terjadi dan
dilakukan pada suhu 50 C, karena suhu ini merupakan suhu yang optimum untuk kerja enzim
papain. Setelah waktu inkubasi selesai, kemudian larutan enzim-substrat ditambahkan larutan
TCA (Asam Tri Kloro Asetat) sebagai penghambat reaksi, sehingga reaksi katalisis dengan
enzim berhenti untuk membatasi reaksi.
Untuk pembanding, dilakukan aktivasi enzim sebagai blanko dengan menambahkan TCA
pada waktu inkubasi=0 sehingga pada larutan blanko ini tidak adaikatan enzim-substrat yang
terbentuk sehingga dapat dijadikan pembanding saat pengukuran absorbansi dengan
spektrofotometer untuk menentukan jumlah reaksi enzim-substrat yang terjadi.
Setelah reaksi berakhir, baik larutan blanko maupun larutan enzim-substrat. Kedua
larutan tersebut diinkubasi kembali untuk mengoptimalkan proses inhibisi enzim-substrat
sehingga tidak ada lagi reaksi diantara enzim substrat. Pemanasan juga dilakukan agar produk
terhindar dari zat-zat pengotor, juga agar terbentuk larutan bening yang selanjutnya digunakan
untuk pengukuran spektrofotometer. Kemudian pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang
gelombang () 280 nm karena panjang gelombang ini merupakan panjang gelombang maksimum
bagi protein. Hasil pengukuran absorbansi larutan enzim-substrat setelah dikurangi dengan
blanko adalah 1,9935 A. Hasil absorbansi blanko lebih kecil, tetapi karena pada alat langsungdi
nol kan sehingga tidak dicatat absorbansi blanko yang diukur.
Namun dapat disimpulkan bahwa terjadi kenaikan antara nilai absorbansi blanko dengan
nilai absorbansi larutan enzim substrat, sehingga dapat disimpulkan bahwa pada larutan enzim-
substrat terjadi pengikatan atau reaksi pembentukan enzim substrat sementara pada larutan
blanko tidak terjadi reaksi enzim substrat.
Untuk pengukuran konsentrasi enzim, dan penentuan aktivasi enzim dilakukan dengan
menggunakan deret standar tirosin dengan variasi konsentrasi. Dari pengukuran ini akan
diperoleh nilai absorbansi yang beragam dan kemudian akan dipolarisasikan dalam grafik,
dimana absorbansi ada pada sumbu x dan konsentrasi pada sumbu y. Namun konsentrasi enzim
tidak dihitung karena substrat kasein tidak divariasikan.