IV.

3 Uji Ninhidrin
Asam amino dan amina lain dapat dioksidasi dengan menggunakan oksidan
lunak ninhidrin, yang menghasilkan suatu hasil berwarna biru. Uji dilakukan dengan
menambahkan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1% kedalam 3 mL larutan protein, kemudian
dipanaskan hingga mendidih. Pembentukan suatu hasil berwarna biru merupakan hasil
reaksi antara ninhidrin, hidrindantin dan amonia yang dikeluarkan dari protein.
R-CH(NH2)-COOH

R-CHO + NH3 + CO2

Ketiga sampel yang diujikan memberi hasil negatif untuk uji ninhidrin karena
tidak membentuk larutan biru. Susu sapi memberikan warna putih keruh, susu kedelai
tidak mengalami perubahan apapun, dan albumin memberikan warna putih setelah
dipanaskan.
O
C

OH
C

OH

HO
+

NH3 +

C
H

O
Ninhidrin

Hidrindantin
O

C
CH
CH

H
N

CH

3H2O

Ninhydrin
O
OH
Tujuan : menunjukkan adanya asam amino Biru
Prosedur : protein + triketohydrindenehidrat
Prinsip reaksi :
Ninhydrin merupakan oksidator yang menyebabkan dekarboksilasi oksidatif dari asam
amino yang menghasilkan CO2, NH3, dan aldehid yang rantainya lebih pendek 1 C dari
asam amino asalnya. Ninhydrin yang tereduksi akan bereaksi dengan NH3 sehingga
membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan absorpsi warna maksimum pada
panjang gelombang 570 nm
IV. 4 Uji Biuret
Uji biuret digunakan untuk menganalisis adanya dua buah ikatan peptida atau
lebih pada suatu protein, akan dapat bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa dan
akan membentuk suatu senyawa kompleks yang berwarna biru ungu. Biuret dihasilkan
dengan pemanasan urea kira-kira pada suhu 180o C. Uji dilakukan dengan

menambahkan 1 mL NaOH kedalam 3 mL larutan protein kemudian diaduk,

tambahkan setetes CuSO4, dan kemudian diaduk lagi.
Reaksi Biuret terjadi pada senyawa yang mempuyai paling sedikit dua ikatan
peptida, karena protein melarutkan Cu(OH)2 dan membentuk persenyawaan dengan Cu.
Warna pada reaksi ini mempengaruhi banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan
peptida. Senyawa dengan dipeptida memberikan warna biru, tripeptida memberikan
warna ungu, tetrapeptida dan peptida kompleks memberikan warna merah pada akhir
reaksi.
Sampel susu sapi, susu kedelai dan albumin memberikan hasil negatif pada uji
ini karena tidak terbentuk kompleks berwarna biru ungu, hal ini menunjukkan bahwa
didalam sampel tersebut hanya memiliki satu ikatan peptida, bukan dua ikatan peptida.
IV.9 Uji Sulfur Dalam Protein
Uji sulfur dalam protein dimaksudkan untuk mendeteksi adanya sulfur dalam
sampel protein. Reagen yang digunakan ialah reagen fusion mixture yang terdiri dari 3
natrium karbonat dan 2 bagian kalium nitrat. Percobaan dilakukan dengan
mencampurkan fusion mixture dan serbuk albumin kemudian dipanaskan dalam cawan
porselin sampai tidak berwarna, lalu didinginkan dan dilarutkan dalam air panas. Saring
bila perlu, filtrat yang diperoleh diasamkan dengan HCl, lalu dipanaskan hinga
mendidih dan ditambahkan beberapa tetes larutan BaCl2. Campuran albumin dan
reagen ketika dipanaskan memberikan larutan berwarna kuning, kemudian setelah
diteteskan beberapa BaCl2 pada larutan terbentuk endapan dan mengakibatkan larutan
menjadi keruh.
Endapan yang terbentuk merupakan endapan putih dari barium karbonat, tidak
larut dalam asam encer, tetapi larut dalam asam pekat, pada praktikum kali ini diguakan
HCl pekat sehingga menyebabkan larutan menjadi keruh karena endapan yang
terbentuk ada sebagian yang melarut.
Sulfur
Tujuan : mengidentifikasi asam amino yang mengandung gugus S (sistein,methionin)
Fungsi reagen : NaOH mengubah S organic menjadi S anorganic
Pb-asetat sbg donor Pb2+
Prinsip reaksi :
SH-CH2-CH(NH3)

+
-COO
Na2S + Pb(CH3COO)2 -> PbS (hitam)
4.3.1 Tes Biuret
Tes biuret merupakan salah satu tes uji protein, bekerja pada suasana basa, dan akan
memberikan perubahan warna pada larutan yang diuji menjadi berwarna violet dengan CuSO4 ,
karena terbentuk kimpleks Cu2+ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam
suasana basa.
Pada tes biuret ini, penambahan NaOH 2,5 M akan mengendapkan protein pada larutan
Albumin, hal ini ditandai dengan bertambah jernihnya larutan albumin yang keruh. Pada larutan
asam amino, penambahan NaOH 2,5 M tidak menyebabkan perubahan yang berarti. Pada
penambahan CuSO4 0,01 M sebanyak 1 tetes menyebabkan larutan albumin mengalami
perubahan yaitu larutan ini tidak tercampur dengan baik dan perubahan warna menjadi ungu
muda atau violet hanya pada permukaan saja, sedangkan pada larutan asam amino glisin dan
alanin terjadi perubahan warna pada permukaanya yaitu berwarna biru, sedangkan pada serin
tidak terjadi perubahan warna. Hal ini disebabkan karena glisin dan alanin mengandung gugus
hidroksil yang dapat membentuk kompleks dengan Cu2+.

Warna biru makin pekat dengan

penambahan CuSO4 berlebih. Setelah dilakukan penambahan CuSO4 0,01 M berlebih, terjadi
perubahan pada semua larutan, baik pada larutan albumin maupun larutan asam amino. Larutan
albumin berwarna ungu muda, dan asam amino yang lain (Serin, Glisin, Alanin,) berwarna biru
muda.

4.3.2 Pengendapan dengan Logam

Diketahui bahwa protein mampu menawarkan racun karena asam amino yang merupakan
penyusun suatu protein dapat mengikat logam seperti Hg (merkuri klorida) dan Pb (timbal
asetat), racun atau logam yang terikat dalam reaksi ini ditandai dengan adanya endapan putih.
Pada reaksi ini, albumin ditambahkan dengan HgCl2 . Pada penambahan ini larutan
berubah dari bening menjadi putih pekat. Hal ini disebabkan karena adanya kemampuan protein
atau asam amino untuk berikatan dengan ion logam di atas titik isoelektriknya. Kemampuan ini
disebabkan karena pada saat pH berada di atas titik isoelektrik protein atau asam amino, maka ia
akan bermuatan negatif sehingga mampu mengikat ion logam yang bermuatan positif.
Berdasarkan teori, titik isoelktrik albumin adalah : 4,55-4,90, alanin 6,00 , glisin 5,97 dan serin
5,68 (titik isoelektrik adalah keadaan pH dimana protein /asam amino memiliki jumlah muatan
positif dan negatif yang sama). Adanya pertambahan ion logam menyebabkan putusnya jembatan
disulfida dan ikatan kovalen S-S pada protein yang mengandung gugus sulfuhidril.
Dengan adanya endapan saat penambahan albumin dan glisin dengan (CH3COO)2 Pb
menunjukkan bahwa protein dan asam amino dapat bertindak sebagai antidotum/penawar racun
pada keracunan logam berat seperti Hg dan Pb. Sedangkan untuk asam amino seperti asam
aspartat, serin, dan alanin tidak membentuk endapan karena suasana larutan masih berada di
bawah titik isoelektrik kedua asam amino tersebut, sehingga asam amino yang bermuatan positif
tidak mampu berikatan dengan ion logam yang bermuatan positif pula. Selain itu, ketiga jenis
asam amino tersebut tidak mengandung gugus sulfuhidril.

4.3.3 Pengendapan dengan Alkohol

Penambahan alkohol yang merupakan pelarut organik akan menurunkan kelarutan
protein, karena kelarutaan suatu protein tergantung dari kedudukan dan distribusi dari gugus

hidrofil polar dan hidrofob polar pada molekul. Mampu mengendapkan logam dalam suasan
asam dan pada pH 4,7 yang merupakan titik isoelektrik.
Pada reaksi pengendapan dengan alkohol, larutan albumin akan membentuk endapan
yang disebabkan karena adanya gugus hidrofobik polar (yang menarik gugus non-polar) didalam
molekul protein dan menghasilkan protein dipol. Menurut teori, albumin + HCl dan albumin +
NaOH membentuk larutan bening sedangkan albumin + buffer asetat pH 4,7 agak keruh. Hal ini
disebabkan karena pada pH 4,7 merupakan titik isoelektrik albumin. Titik isoelektrik merupakan
pH dimana kelarutn protein minimum karena jumlah ion positif dan ion negatif sama sehingga
penambahan senyawa organik seperti aseton dan alkohol yang bersifat nonpolar (muatan = 0)
cenderung menurunkan kelarutan protein. Sedangkan dengan penambahan asam atau basa
menyebabkan larutan albumin kelihatan agak bening, hal ini menandakan naiknya kelarutan
albumin. Hal ini berdasarkan sifat protein yang amfoter (protein dalam suasana pelarut yang
bersifat asam akan bertindak sebagai basa dan dalam suasana pelarut yang bersifat basa akan
bertindak sebagai asam).