Pada percobaan ini dilakukan percobaan untuk menentukan Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar

Protease. Percobaan ini bertujuan untuk memahami dan melakukan penentuan aktivitas ekstrak
kasar protease, penentuan kadar protein dengan metoda Lowry, dan menentukan aktivitas spesifik
ekstrak kasar protease. Sampel yang digunakan pada percobaan ini adalah Pseudomonas sp..
Percobaan ini dilakukan dengan cara yang pertama pembuatan media yang meliputi media starter
dan media produksi dimana dilakukan oleh asisten sesuai jadwal yang telah ditentukan. Pembuatan
media stater dilakukan dengan cara melarutkan 0.16 g nutrient broth (NB) dalam 20 mL akuades
hingga homogen, diautoklaf pada temperatur 121 oC, tekanan 15 psi selama 15 menit. Hal ini
dilakukan sebagai pembuatan media untuk starter. Pembuatan media cair dilakukan dengan cara
melarutkan 0,38 g pepton, 0,25 g glukosa, 0,25 g KH2PO4, 0,25 g MgSO4.7H2O, dan 0,005 g
FeSO4.7H2O dalam akuades, diatur pH 7,0. Diautoklaf pada temperatur 121 oC, tekanan 15 psi
selama 15 menit. Hal ini dilakukan sebagai pembuatan media untuk produksi ekstrak kasar protease.
Kemudian dilakukan pembuatan starter yang dilakukan oleh asisten dengan diambil isolat mikroba
yang akan dianalisa (isolat MD 24) dengan tusuk gigi steril atau kawat ose sebanyak 2 ose dan
inokulasikan dalam 20 ml media stater. Inkubasi inokulum pada shaking incubator dengan
pengojogan sekitar 100 rpm (rotary per minute) selama semalam pada 37 oC. Starter adalah
populasi mikroba dalam jumlah dan kondisi fisiologis yang siap diinokulasikan pada media
fermentasi. Selanjutnya dilakukan produksi ekstrak kasar protease yang dilakukan oleh asisten
dengan diambil biakan stater (kira-kira berumur 20 jam) sebanyak 2 mL dengan pipet mikro dan
diinokulasikan pada 50 mL media produksi. Media produksi diinkubasi dengan penggojogan 100 rpm
menggunakan shaker inkubator pada temperatur 37 °C selama 2-5 hari. Kultur media produksi ini
selanjutnya digunakan untuk pengujian aktivitas protease.

Selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas protease dengan Kultur dalam media produksi yang telah
mencapai waktu produksi tertentu (2-5 hari) disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5
menit. Hal ini dilakukan Untuk memisahkan enzim dari sel, sehingga diperoleh supernatan (ektrak
kasarprotease). Supernatan yang mengandung enzim protease ekstraseluler disebut dengan ekstrak
kasar enzim, karena masih banyak mengandung komponen sisa media dan enzim-enzim
ekstraseluler lain yang dihasilkan mikroba, yang kemudian aktivitasnya akan dibandingkan dengan
aktivitas protease tripsin. Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas enzim protease pada
menit ke-0 dan pada menit ke-20. Pada penentuan aktivitas enzim protease pada 0 menit disiapkan
dua buah tabung reaksi bersih yang diberi kode AT0(aktivitas tripsin pada 0 menit) dan AE0(aktivitas
ekstrak kasar protease pada 0 menit). Kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung 2 mL
larutan buffer fosfat 0,1 M pH 8 dan ditambahkan 1 mL larutan tripsin 0,4 % pada AT0 dan 1 mL
ekstrak kasar enzim pada AE0. Penambahan buffer fosfat bertujuan untuk mengaktifkan enzim dan
untuk mempertahankan pH dan penambahan larutan tripsin dan ekstrak kasar enzim bertujuan
untuk menghidrolisis kasein. Kemudian Ditambah masing-masing tabung 3 mL larutan TCA 20%
Untuk menghentikan jalannya reaksi kerja enzim dengan cara mendenaturasi protein. Setelah itu,
divortek dengan kuat agar campuran homogen dan diinkubasi selama 30 menit dalam penangas
35oC Untuk mencapai suhu optimum enzim. Selanjutnya Ditambahkan 4 mL larutan kasein 2%
sebagai substrat dan divoertek agar campuran homogen. Kemudian Direndam tabung dalam air es
selama 15 menit Untuk menghambat reaksi enzimatik dan Disentrifugasi selama 5 menit Untuk
memisahkan endapan dari campuran larutan sehingga didapatkan filtrat yang jernih. Setelah itu,
Dipindahkan supernatan ke tabung reaksi dan diukur serapannya dengan metode ANSON Untuk
menentukan aktivitas dari tripsin dan ekstrak kasar protease dan kadar proteinnya.

Pada penentuan aktivitas enzim protease pada 20 menit disiapkan dua buah tabung reaksi bersih
yang diberi kode AT20(aktivitas tripsin pada 20 menit) dan AE20(aktivitas ekstrak kasar protease
pada 20 menit). Kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung 4 mL kasein 2% sebagai
substrat dan diinkubasi selama 5 menit pada penangas 35 oC Untuk mencapai suhu optimum enzim.
Setelah itu, Ditambah 2 mL larutan buffer fosfat 0,1 M pH 8 Untuk mengaktifkan enzim dan
mempertahankan pH dan Divortek sebentar agar campuran homogen. Selanjutnya, Ditambahkan 1
mL larutan tripsin 0,4% pada AT20 dan 1 mL ekstrak kasar enzim pada AE20 Untuk menghidrolisis
kasein. Kemudian Divortek dan dilanjutkan inkubasinya selama 20 menit Agar campuran homogen
dan untuk mencapai suhu optimum enzim. Setelah itu, Ditambahkan 3 mL TCA 20% pada masing-
masing tabung Untuk menghentikan jalannya reaksikerja enzim dengan cara mendenaturasi protein
dan Divortek dengan kuat agar campuran homogen. Selanjutnya Direndam tabung dalam air es
selama 15 menit Untuk menghambat reaksi enzimatik dan Disentrifugasi selama 5 menit Untuk
memisahkan endapan dari campuran larutan sehingga didapatkan filtrat yang jernih. Setelah itu,
Dipindahkan supernatan ke tabung reaksi dan diukur serapannya dengan metode ANSON Untuk
menentukan aktivitas dari tripsin dan ekstrak kasar protease dan kadar proteinnya. Pada penentuan
konsentrasi peptide pendek terlarut hasil reaksi enzim protease dengan metoda ANSON diiapkan 4
tabung reaksi yang masing-masing telah berisi 2 mL supernatan yang mengandung produk hasil
reaksi sesuai dengan kode-kode percobaan di atas (AT0, AE0, AT20 dan AE20). Kemudian
dambahkan 4 mL NaOH 0,5 M pada masing-masing tabung sebagai pemberi suasana basa. Setelah
itu, ditambahkan 1 mL larutan Folin Ciocalteu untuk Membentuk larutan berwarna dan untuk
mengetahui hasil absorbansi pada spektofotometer, dan divortek hingga homogen. Selanjutnya
didiiamkan selama 5 menit, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 650 nm untuk
menentukan aktivitas protease.

Selanjutnya dilakukan penentuan konsentrasi protein dengan metode Lowry dengan dibuat serial
larutan protein standar berbagai konsentrasi dari stok larutan Bovine Serum Albumin 200 µg/mL
sebagai standar konsentrasi dalam membuat kurva. Kemudian disiapkan tabung 8 berisi 1 mL larutan
tripsin dan tabung 9 berisi 1 mL ekstrak kasae enzim dan dtambahkan 5 mL pereaksi Biuret ke dalam
masing-masing tabung reaksi Untuk membentuk kompleks Cu-protein (kompleks Cu-protein yang
dihasilkan oleh pereaksi biuret dmana akan mereduksi hampir 75% fosfotungstat dan fosfomolibdat
dalam pereaksi Folin-Ciocalteu. Setelah itu, diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit Untuk
menyempurnakan reaksi pada suhu optimum. Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL pereaksi Folin-
Ciocalteu ke dalam masing-masing tabung untuk membentuk larutan berwarna dan untuk
mengetahui hasil absorbansi pada spektofotometer, dan segera diaduk hingga merata. Kemudian
diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit Untuk menyempurnakan reaksi pada suhu optimum.
Setelah itu, dibaca absorbansi pada panjang gelombang 750 nm dengan tabung 1 sebagai blanko
Untuk menentukan konsentrasi protein berdasarkan absorbansi.

Berdasarkan hasil data penentuan konsentrasi protein menggunakan metode Lowry diperoleh kurva
standar protein sebagai berikut.

KURVA

LAPSEM