PROSEDUR KERJA PROSES PCR

1. Ektraksi DNA

Sampel isolat bakteri dimasukkan dalam tabung 1,5 ml ditambahkan 200 µL PBS buffer

dan 20 µL proteinase K ditambahkan kedalam endapan divorteks dan diinkubasi pada

suhu 60ᵒC selama 30 menit, selama inkubasi divorteks tiap 5 menit. Kemudian 200 µL

GSB buffer dimasukkan kedalam tabung dan divorteks, selanjutnya diinkubasi pada suhu

60ᵒC selama 5 menit selama inkubasi divoerteks tiap 2 menit. Ditambahkan 200 µL

etanol absolut dan divorteks selama 10 detik., selanjutnya disiapkan tabung GS coloumb

dalam tabung koleksi. Kemudian dipindahkan campuran pada tabung GS coloumb

kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Cairan

dalam tabung koleksi dibuang dan tabung koleksi dipasang kembali, lalu 400 µL W1

buffer ditambahkan kedalam tabung GS coloumb kemudian dilakukan sentrifugasi pada

kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya GS coloumb dipindahkan pada tabung

koleksi baru, lalu 600 µL wash buffer + etanol ditambahkan ke dalam GS coloumb

kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya tabung

GS dipindahkan pada tabung koleksi baru kemudian disentirufugasi pada kecepatan

12.000 selama 2 menit dalam keadaan kering. Selanjutnya GS coloumb ditransfer pada

tabung 1,5 Ml steril 100 µL elution buffer dimasukkan kedalam GS coloumb dan

dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit

2. Amplifikasi DNA

PCR dilakukan dengan menggunakan kit reagen My Taq HS dalam volume reaksi 25 µL

yang terdiri atas 12,5 µL master mix, 1 µL masing - masing primer, 8,5 µL water free

nuclease dan 2 µL DNA tamplate. Proses amplifikasi dilakukan dalam mesin PCR

dengan kondisi pra denaturasi pada suhu 94 ᵒC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94

ᵒC selama 30 detik, penempelan pada suhu 55 ᵒC selama 1 menit, dan pemanjangan pada

suhu 72 ᵒC selama 1 menit 30 detik dan final extension 72ᵒC selama 7 menit. Siklus ini

diulangi sebanyak 35 kali.

3. Analisis hasil PCR dengan elektroforesis

hasil amplifikasi DNA dilakukan proses elektroforesis terhadap produk PCR pada gel

agarosa 2%. Gel agarosa dibuat dengan cara melarutkan 0,60 gr agarosa dalam 30 ml

buffer TAE Ph 8 dipanaskan sampai mendidi. Setelah dihomogenkan adan agar dingin

(sekitar 60ᵒC) kemudian ditambahkan Gelred (1µL/30 ml).larutan agarosa kemudian

dituang ke dalam baki gel agarosa, sisir elektroforesis dipadang pada salah satu ujung

baki gel agarosa. Setelah gel memadat, sisir dilepas dengan hati-hati. Posisi baki diatur

dan buffer 1X TAE pH 8,0 500 Ml dituang ke dalam tangki elektroforesis. Selanjutnya

campuran 10 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa, Voltase, arus

dan waktu running diatur 80 V, 45 A dan 45 menit. Setelah elektroforesis selesai, gel

diletakkan dibawah UV Transilluminator selanjutnya diamati pita-pita DNA yang

tervisualisasi.