Analisis Kuantitatif Gula Pereduksi Metode Somogyi-Nelson

1. Prinsip
Metode ini digunakan untuk menentukan kadar glukosa dalam darah. Protein
diendapkan dengan ZnSO4 dan Ba(OH)2. Kupri oksida dioksidasi oleh larutan tembaga alkali
dengan membentuk kupro oksida (CuO), kemudian kupro oksida ini dioksidasi kembali
dengan asam arsen molibdat yang akan membentuk warna biru arsenomolibdat.
2. Cara membuat pereaksi
Larutan ZnSO4 5%
Larutkan 50 g ZnSO4 . 7 H2O dengan aquades dalam labu ukur dan tera hingga
volume akhirnya menjadi 1000 mL.
Barium hidroksida 0,3 N
Larutkan 47,295 g Ba(OH)2 . 8 H2O dengan aquades dalam labu ukur dan tera hingga
volume akhirnya menjadi 1000 mL. Larutan ini harus distandarisasi terhadap larutan ZnSO 4
5% dengan cara mentitrasinya dengan indikator fenolftalein. Sebanyak 10 mL larutan ZnSO 4
5% diencerkan dengan 100 mL aquades, lalu tambahkan satu tetes fenolftalein dalam
erlenmeyer 250 mL, dan titrasi dengan larutan Ba(OH) 2 0,3 N harus tepat 10 mL, bila tidak,
maka sempurnakan agar dapat tepat 10 mL dan titrasi ulang.
Pereaksi tembaga alkali (Somogyi)
Larutkan 28 g Na2PO4 anhidrat dan 40 g garam K-Na-tartrat (garam Rochelle) dalam
700 mL aquades. Tambahkan 100 mL NaOH 1 N,lalu campur. Dengan pengadukan cepat,
tambahkan 80 mL CuSO4 10%, kemudian tambahkan 180 g Na 2SO4 anhidrat. Setelah
tercampur sempurna, tera dengan aquades hingga volume akhirnya menjadi 1000 mL.
Biarkan selama 2 hari dan saring dengan kertas saring Whatman No. 40. Larutan ini dapat
bertahan dalam waktu lama. Fungsi garam Rochelle adalah untuk menstabilkan warna.
Pereaksi arsenomolibdat (Nelson)
Larutkan 25 g amonium molibdat dalam 450 mL aquades, dan secara hati-hati
tambahkan sedikit demi sedikit 21 mL H2SO4 pekat. Larutkan 3 g NaHAsO 4 . 7 H2O dalam
25 mL aquades dan tambahkan asam molibdat, lalu campurkan baik-baik dan tempatkan
dalam inkubator 37oC selama 48 jam. Bila ingin cepat digunakan, maka tempatkan pada suhu
55oC selama 25 menit sambil diaduk untuk mencegah kelebihan panas pada bagian tertentu
yang dapat menyebabkan perubahan warna. Simpan pereaksi pada botol berwarna gelap dan
tertutup.
Standar glukosa
Standar glukosa ini mengandung glukosa 0,05 mg/mL. Larutkan 5 mL larutan
glukosa stok (1 g glukosa dalam 100 mL asam benzoat 0,25%). Encerkan dengan larutan
asam benzoat 0,25% menjadi 1000 mL.
3. Metode

Sebanyak 1 mL sampel darah dalam erlenmeyer ditambahkan 15 mL aquades.

Campur perlahan dan tambahkan 2 mL 0,3 N Ba(OH) 2 dan campur. Setelah campuran
berubah menjadi berwarna cokelat, tambahkan 2 mL ZnSO 4 5%, kemudian aduk dan saring.
Siapkan 3 tabung Folin-Wu, yang masing-masing terdiri dari :
Blanko diisi dengan 2 mL aquades
Sampel diisi dengan 2 mL filtrat darah
Standar diisi dengan 2 mL glukosa standar
Ke dalam masing-masing tabung, tambahkan 2 mL larutan CuSO 4 alkali dan campur.
Tempatkan masing-masing tabung tersebut dalam air mendidih tepat 10 menit, lalu pindahkan
ke dalam air dingin selama 3 menit. Tambahkan 2 mL pereaksi arsenomolibdat ke dalam
masing-masing tabung, campur, dan encerkan masing-masing larutan dengan aquades hingga
volume akhirnya menjadi 25 mL. Tutup dan kocok beberapa kali agar bercampur, lalu ukur
absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm, dengan nilai nol
untuk blanko.
4. Penyiapan kurva standar
a. Buat larutan glukosa standar (10 mg glukosa anhidrat/100 mL)
b. Dari larutan glukosa, lakukan 6 kali pengenceran, sehingga diperoleh larutan glukosa standar
c.

dengan konsentrasi masing-masing 2,0; 4,0; 5,0; 6,0; 8,0; dan 10 mg/100 mL.
Siapkan 7 tabung reaksi yang bersih dan kering, kemudian isilah masing-masing dari keenam
tabung dengan 1 mL larutan glukosa standar di atas, sedangkan satu tabung lainnya isi

dengan 1 mL aquades sebagai blanko.

d. Ke dalam setiap tabung di atas, tambahkan 1 mL pereaksi Nelson, lalu panaskan semua
e.

tabung dalam penangas air mendidih selama 20 menit.

Ambil semua tabung dan segera dinginkan bersama-sama dengan memasukkan ke dalam

gelas kimia yang berisi air dingin, sehingga suhu tabung mencapai 25oC.
f. Setelah dingin, tambahkan ke dalam setiap tabung 1 mL pereaksi Arsenomolibdat. Gojok
sampai semua endapan Cu2O yang ada larut kembali.
g. Setelah semua endapan Cu2O larut sempurna, tambahkan 7 mL aquades dan gojoklah sampai
homogen.
h. Selanjutnya, baca serapan atau absorbansi (A) masing-masing larutan pada spektrofotometer
i.

dengan panjang gelombang 540 nm.

Buat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara kadar glukosa dan absorbansi.
untuk menggambarkan kurva hubungan kadar dan absorbansi, dapat digunakan
metode kuadrat terkecil (Least-Squares) agar diperoleh garis lurus yang konstan. Metode
sering digunakan untuk menentukan ketepatan garis yang terbaik pada pembuatan kurva baku
(standar).

Persamaan Least-Squares yang menjelaskan satu garis lurus (linier) diberikan oleh
persamaan :
X=aY+b
dengan :
X (absis)

= Kadar larutan glukosa standar (mg/100 mL)

Y (ordinat)

= Absorbansi

a dan b

= Tetapan yang dihitung dari persamaan

a = {N (xy) - (x) (y)} / {(y2) (y2)}

a = {(y2) (x) - (y) (xy)} / {N (y2) (y2)}

dengan :
N = Banyaknya pengamatan
B. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode Dinitrosalisilat (DNS)
1. Prinsip
Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri.
Teknik ini hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa memiliki
gugus aldehida, sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Gugus aldehida yang
dimiliki oleh glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil
dan menghasilkan asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa dengan suhu 90-100 oC.
Senyawa ini dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
2. Cara membuat pereaksi DNS
Sebanyak 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH 2 N dilarutkan dalam 100 mL
aquades (larutan A). Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam 200 mL
aquades (larutan B). Larutan A dan B dicampur, lalu ditera dalam labu takar dengan aquades
hingga volume akhirnya menjadi 500 mL, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik
selama satu malam.
3. Metode
Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 200, 400, 800,
1200, 1600, dan 2000 ppm. Masing-masing larutan diambil 1 mL, lalu tambahkan 3 mL
pereaksi DNS. Kemudian, masing-masing larutan divorteks dan dipanaskan dalam air

mendidih selama 5 menit. Setelah dingin, masing-masing larutan diencerkan 5 kali dan
divorteks kembali. Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540
nm, kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar. Pengukuran kadar gula
pereduksi pada sampel dilakukan dengan cara mengambil 1 mL sampel kemudian
ditambahkan 3 mL pereaksi DNS. Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa
standar, kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.
C. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode Asam Fenol Sulfat
1. Prinsip
Metode ini disebut juga dengan metode TS (total sugar) yang digunakan untuk
mengukur total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula
sederhana, oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat
pekat yang akan menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil.
2. Metode
Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 100, 200, 300,
400, dan 500 ppm. Masukkan 0,5 mL dari masing-masing larutan ke dalam tabung yang
terpisah, kemudian rendam dalam air, lalu tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H 2SO4
pekat dengan hati-hati melalui dinding tabung. Biarkan selama 10 menit, lalu vorteks dan
biarkan kembali selama 20 menit. Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 490 nm, kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar. Pengukuran
sampel dilakukan dengan cara memasukkan 0,5 mL larutan sampel ke dalam tabung, lalu
rendam dalam air, kemudian tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H 2SO4 secara hati-hati.
Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai pengukuran
yang diperoleh diplot pada kurva standar.
D. Analisis Kuantitatif Gula Pereduksi Metode Lane-Eynon
1. Prinsip
Penentuan gula cara ini adalah dengan cara menitrasi reagen soxhlet (larutan
CuSO4K-Na tartrat) dengan larutan gula yang diselidiki. Banyaknya larutan contoh yang
dibutuhkan untuk menitrasi reagen soxhlet dapat diketahui banyaknya gula yang ada dengan
melihat pada tabel Lane-Eynon. Pada titrasi reagen soxhlet dengan larutan gula akan berakhir
apabila warna larutan berubah dari biru menjadi tidak berwarna. Indikator yang digunakan
pada cara ini adalah methilen blue.
E. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode Anthrone

Dasar dari reaksi ini adalah kemampuan karbohidrat untuk membentuk turunan
furfural dengan keberadaan asam dan panas, yang kemudian diikuti dengan reaksi dengan
anthrone yang menghasilkan warna biru kehijauan.
Uji Anthrone ini memiliki kelebihan dalam hal sensitifitas dan kesederhanaan
ujinya(Koehler 1952).Sejumlah kecil karbohidrat dapat memberikan warna yang terdeteksi
denganmenggunakan spektrofotometer.
Kekurangan dari Metode Anthrone adalah ketidakstabilan dari reagen (anthrone
yangdilarutkan dalam asam sulfat), sehingga perlu dilakukan persiapan reagen yang baru
setiap hari.