Laporan Praktikum

Modul Sel Genetika BioMolekuler

SALTING OUT, SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPH, DAN
ELEKTROFORESIS

Kelompok DK 15
Dian Aris Priyanti [1406528144]
Farah Vidiast [1406577562]
Maryam Ulfa [1406527772]
Nadya Farhana [1406599310]
Nurul Falahiyyah Bahri [1406527955]
Radityo Adi [1406571666]
Stevanus Samudra [1406566602]
Skolastika Mitzy [1406599090]
Yosilia Nursakina [1406570026]
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS INDONESIA
JAKARTA
2014
SALTING OUT
I.

Landasan Teori
Salting out adalah suatu cara pengendapan protein dalam larutan yang memiliki
kekuatan ionik sangat tinggi dengan memanfaatkan pengurangan kelarutan pada molekul
tertentu. Untuk mengendapkan molekul secara selektif, dapat digunakan tipe dan
konsentrasi garam yang bermacam-macam. Meskipun salting out memiliki kekurangan

dalam ketepatan mengisolasi protein tertentu, namun dalam kenyataanya salting out
masih merupakan suatu cara yang efektif untuk pengendapan molekul awal.
Interaksi dari hidrofobik dan hidrofilik dengan lingkungan seluler menyebabkan
konformasi (penyesuaian) pada biomolekul besar untuk terurai. Interaksi ini
menyebabkan pelipatan dimana kebanyakan grup fungsional hidrofobik terlindungi dari
lingkungan seluler polar sehingga tercapai konformasi akhir. Semua bagian hidrofilik dari
molekul tertinggal untuk berinteraksi dengan air sementara bagian hidrofobik dari
molekul berkumpul bersama untuk mencapai konformasi ini. Salting out terjadi karena
penyeleksian yang dilakukan oleh asam amino pada protein. Air diperintahkan oleh asam
amino polar seperti lisin, glutamate, dan tirosin untuk mengelilingi mereka sehingga
mereka tinggal terlarut. Molekul air akan mengelilingi kumpulan ion dan protein pada
pada lingkungan cair dengan kekuatan ionik tinggi. Pengendapan dari zat yang dilarutkan
seperti protein dan molekul organic besar adalah hasilnya.
II.

III.

Alat dan Bahan

1 Tabung Reaksi
2 Kertas Saring
3 Pipa tetes
4 Mikropipet
5 Corong
6 Larutan amonium sulfat, (NH4)2 SO4 jenuh
7 Larutan NaCl 1%
8 Larutan NaOH
Langkah Kerja
1 Masukkan 7,28 gram (NH4)2SO4 ke dalam 25 ml serum. Aduk hingga rata.
2 Substrat tersebut kemudian disaring ke dalam tabung reaksi menggunakan kertas
3

saring yang sudah dilipat empat dan dijadikan seperti corong

Akan ada endapan dan filtrat dari saringan pertama tersebut atau disebut juga sebagai

precipitate 50% dan filtrate 50%

Lakukan uji biuret kepada precipitate 50% dengan mencampurkan precipitate + 2 ml
NaCl 1% + 2 ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi

yang kosong (tabung P1). Lihat hasilnya

Lakukan Uji biuret kepada filtrate 50% dengan mengambil 0,5 ml filtrate + 1.5 ml
NaCL 1% + 2 ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
kosong (tabung F1)

Ambil filtrate saringan pertama, disaring

ke dalam tabung reaksi lain menggunakan
kertas saring yang dilipat empat dan

dijadikan seperti corong

Lakukan uji biuret kepada precipitate
100% dengan mencampurkan precipitate
+ 2 ml NaCl 1% + 2 ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung

reaksi yang kosong (tabung P2). Lihat hasilnya

Lakukan Uji biuret kepada filtrate 100 % dengan mengambil 0,5 ml filtrate + 1.5 ml
NaCL 1% + 2 ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
kosong (tabung F2). Lihat hasilnya

IV.

Hasil Kerja
P1 : tabung yang merupakan hasil dari uji biuret pada precipitate 50%. Berwarna paling
ungu karena mengandung protein-protein besar yang tidak tersaring
F1 : tabung yang merupakan hasil dari uji biuret pada filtrate 50%. Berwarna lebih muda
dari P1 karena protein besar pada P1 tidak tersaring menjadi F1
P2 : merupakan hasil uji biuret dari precipitate 100 %. Pada gambar terlihat memiliki
warna yang sama dengan P1, dan lebih tua dari warna F1. Merupakan hasil endapan
protein-protein sedang dari filtrate 50%
F2 : merupakan hasil uji biuret pada filtrate 100%. Berwarna sangat muda karena sudah
tidak memiliki protein.

V.

Referensi
Core [internet]. [place unknown]. [chemwiki.ucdavis.edu]; [date unknown] [cited 15
Februari 2015] Available from:
https://www.health.ny.gov/professionals/ems/pdf/srgpslongbones.pdf

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPH

I.

Tujuan
a Memisahkan molekul protein berdasarkan ukuran/beratnya.
b Memisahkan protein hemoglobin dengan vitamin B12 yang terkandung dalam darah
dengan menggunakan kolom kromatografi gel penyaring.

II.

Landasan Teori
Kromatografi adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan molekul yang
bercampur dalam suatu larutan. Pada teknik ini, molekul yang bercampur tersebut akan
terpisah ke dalam dua fasa yaitu fasa stasioner dan fasa mobil (disebut juga eluen). Fasa
stasioner adalah molekul yang dapat bergerak sedangkan fasa stasioner adalah molekul
yang diam/tidak dapat bergerak. Proses pergerakan molekul akibat dari eluen disebut
sebagai elusi.
Teknik pemisahan

molekul

dengan

metode

kromatografi

pada

umumnya

menggunakan kolom yang berisi matriks tertentu yang dipadatkan. Matriks di dalam
kolom tersebut berperan sebagai fasa stasioner. Matriks pada kolom tersebut dibuat
sedemikian rupa sehingga dapat menyeleksi molekul yang melewatinya, berdasarkan
kriteria tertentu, misalnya kelarutan, berat, ukuran, dan lain sebagainya. Pemisahan ini

akan selesai ketika elusi telah berakhir. Dengan kata lain, seluruh campuran molekul
yang akan dipisahkan tersebut telah semuanya keluar dari kolom penyaring. Dengan
menggunakan elusi yang sesuai, molekul-molekul tersebut akan keluar sesuai urutan
dalam kriteria yang ditentukan, misalnya mulain dari molekul yang berat hingga yang
ringan.
Matriks yang digunakan dalam teknik ini berupa gel yang berisi butiran-butiran
mikroskopis dekstran yang dipadatkan. Molekul yang memasuki matriks, dengan dibantu
eluen, akan terpisah berdasarkan ukuran molekul (mencerminkan berat molekul).
Molekul protein yang berukuran lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori sehingga
lajunya tertahan dan membutuhkan waktu keluar lebih lama. Sementara itu, molekul
protein dengan ukuran yang lebih besar akan lolos dari pori-pori dan terus melaju di
sepanjang kolom. Dengan begitu, molekul dengan ukuran besar akan keluar terlebih
dahulu dibandingkan dengan molekul yang ukurannya lebih kecil. Oleh karena itu,
teknik ini biasa juga disebut dengan size exclusion chromatography atau molecular sieve
chromatography.
III.

Alat, Bahan, dan Metode

Alat:
1 Tabung reaksi
2 Sizing column
3 Pipet
4 Mikropipet
5 Spektrofotometri
Bahan:
1 Campuran protein hemoglobin dan vitamin B12
2 Matriks gel penyaring
3 Dapar NaCl 0,1M + Azida
4 Akuades

Gambar: Alat kerja

praktikum

Langkah Kerja:
1
2

Siapkan 15 tabung reaksi dengan dilabelkan 1-14 dan tabung terakhir dilabel sisa.
Lakukan up and down pada tabung berisikan campuran protein hemoglobin dan

vitamin B12 hingga campuran tersebut homogen.

Buka penutup atas dan bawah kolom gel penyaring. Tunggu hingga larutan dapar di

atas permukaan gel penyaring menetes keluar hingga habis.

Beri 2 tetes campuran protein dengan menggunakan pipet tetes ke atas permukaan gel
penyaring, kemudian tambahkan dua tetes dapar melalui diding kolom gel penyaring.

5
6

Tampung fraksi 3 tetes pada tabung pertama.

Pindahkan kolom gel penyaring ke tabung reaksi selanjutnya setelah 3 tetes.
Setelah 15 tabung reaksi terisi oleh fraksi 3 tetes, tutup kembali bagian bawah kolom

gel penyaring.
Tambahkan akuades sebanyak 1 ml dengan menggunakan mikropipet ke dalam tiap

tabung reaksi. Campurkan hingga menjadi homogen.

Untuk mendapatkan hasil yang akurat, ukur serapan pada masing-masing tabung

reaksi dengan menggunakan spektrofotometri.

Catat hasil yang diukur, kemudian tuangkan ke dalam bentuk tabel dan kurva untuk
dapat memperjelas kesimpulan.

IV.

Hasil Pengamatan

Dari tetesan sampel idapat hasil warna yang berbeda dari 12 tabung yang
digunakan. Masing-masing tabung memiliki perubahan warna yang tidak begitu jauh.
Dari hasil percobaan didapatkan hasil berikut :
Setelah selesai, daya serap larutan tersebut pun kemudian diukur pada
spektrofotometer. Berikut ini adalah hasil percobaan yang diberi label 1-14 dari kiri ke
kanan beserta hasil spektrofotometrinya.

Tabung

Warna

Tidak
berwarna

Tidak

Tidak
berwarna

Merah
Gelap

Merah
Gelap

Merah

Merah

+++

++

+++

++

Intensitas
(++)
Serapan
()

Tabung

berwarna
-

0.246

0.093

0.111

0.626

0.258

0.280

0.246

10

11

12

13

14

Warna

Merah

Intensita
s
(++)
Serapan
()

Merah
Muda
+

Merah
Muda
++

Merah
Muda
+++

Merah
Muda
++

Merah
Muda
+

Tidak
Berwarna
-

0.204

0.180

0.150

0.101

0.207

0.201

0.204

Tabel Nilai Absorbansi

Dari hasil diatas maka dapat dibuat kurva dengan sumbu x adalah nomor tabung
dan sumbu y sebagai fraksi warna hasil pengukuran spectrofothometer. Berikut adalah
kurva yang diperoleh :

Grafik Hasil Kromatografi

0.7
0.6
0.5
0.4
Fraksi Kromatografi 0.3
0.2
0.1
0
1

10 11 12 13 14

Nomer Tabung Reaksi

V.

Analisis
Percobaan kromatografi gel penyaring dilakukan untuk memisahkan protein
berdasarkan ukuran molekulnya. Pada percobaan ini, protein yang digunakan adalah
protein Hb dan B12 yang dituangkan ke dalam agar pada sizing column. Protein Hb
memiliki ukuran molekul yang lebih besar dibandingkan B12.
Agar-agar yang diletakkan pada sizing column memiliki pori-pori tertentu yang
lebih besar dari ukuran molekul B12 tetapi lebih kecil dari ukuran molekul Hb. Sehingga
ketika protein campuran Hb dan B12 dituangkan ke dalam sizing column, protein B12

akan masuk ke dalam pori-pori agar , sedangkan protein Hb akan langsung turun ke
bagian bawah sizing column. Oleh karena itu, ketika tutup sizing column dibuka, gel
yang menetes pada tabung reaksi awal akan berwarna lebih merah karena mengandung
Hb dan gel-gel yang diteteskan pada tabung reaksi berikutnya akan berwarna lebih muda
dan transparan karena sudah tidak mengandung Hb. Kemudian pada masing-masing
tabung ditambahkan aquades sebanyak 1 mL agar larutan lebih terlihat.
Pada grafik hasil absorbansi terlihat adanya 2 puncak grafik yaitu pada tabung 4
dengan nilai absorbansi 0,626 yang menunjukkan nilai absorbansi molekul Hb.
Sedangkan puncak ke-2 terlihat pada tabung 6 yang memiliki nilai absorbansi 0,280
menunjukkan nilai absorbansi molekul B12. Sementara puncak grafik yang lain muncul
akibat adanya kontaminan pada larutan hasil kromatografi.
VI.

Kesimpulan
Kromatografi kolom adalah metode pemisahan protein sesuai ukuran dan berat
molekul. Molekul yang paling berat dan berukurn lebih besar akan keluar lebih dulu dari
kolom. Dalam percobaan ini diketahui bahwa molekul-molekul hemoglobin adalah
molekul yang besar dan akan keluar lebih dulu dibanding molekul dari vitamin B 12. Pada
grafik, pucak pertama menunjukkan nilai absorbansi maksimum dari protein Hb
sedangkan puncak kedua merupakan nilai absorbansi maksimum protein B12.

ELEKTROFORESIS
I

Pendahuluan

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan partikel, ion, atau koloid berdasarkan

kemampuan berpindahnya melalui medium konduktif(pelarut buffer) terhadap respon adanya
medan listrik. Selain itu, elektroforesis juga diartikan sebagai migrasi partikel yang
bermuatan akibat adanya arus listrik searah (Direct Current). Larutan buffer pada proses
elektroforesis berfungsi sebagai konduktor dan menjadi jembatan konduksi antara dua
elektroda pada chamber elektroforesis, sehingga adanya aliran medan listrik. Biasanya,
elektroforesis dilakukan untuk memisahkan segmen DNA.
II Tujuan Percobaan
Tujuan dari elektroforesis adalah menentukan muatan suatu partikel, dalam percobaan ini
yaitu protein.
III Landasan Teori
Prinsip kerja elektroforesis yaitu adanya pergerakan partikel bermuatan positif ke kutub
negatif dan partikel bermuatan negatif ke kutub positif. Gerak partikel ini disebut sebagai
gerakan elektrokinetik. Hasil dari elektroforesis disebut dengan elektroforegram yang
menentukan kecepatan migrasi suatu partikel.
IV Alat-Alat Praktikum
1 Chamber elektroforesis
2 Plate
3 Filter papers
4 Power supply
5 Alat pengepress dan tatakan cetak
6 Micropipet
7 Pinset
8 Membran selulosa asetat
V Bahan Praktikum
1 Serum
2 BSA (Bovine Serum Albumine)
3 Precipitate 50% (P50) : Globulin
4 Filtrate 50% (F50) : Albumin
5 Precipitate 100% : Albumin
6 Filtrate 100% : No protein
7 Buffer Barbital
8 Ponceau S stain
9 Acetic Acid 5%
VI Cara Kerja
1 Menyiapkan alat dan bahan

2
3
4

Merendam membrane selulosa di dalam buffer barbital selama 15 menit

Menyiapkan chamber elektroforesis dengan mengisinya menggunakan buffer barbital
Plate yang berlubang-lubang diisi dengan menggunakan sampel ( Serum pertama, BSA

kedua dan seterusnya) sebanyak 5 mikroliter masing-masing berurutan.

Mengangkat membrane selulosa asetat dengan menggunakan

pinset

lalu

mengeringkannya dengan melapisnya memakai filter papers ( seperti sandwich membran

6

diletakkan di tengah)
Mengepress plate yang berisi sampel sebanyak 6 lubang kesamping ( Serum, BSA, dan
seterusnya) dengan menggunakan alat cetakkan sebanyak 3 kali dorongan, lalu segera
mencetaknya pada membrane selulosa asetat yang sudah diletakkan pada tatakan cetak

dan tahan selama 10 detik

Membran yang sudah di cetak tersebut diletakkan pada bak elektroforesis yang telah
disediakan dengan posisi katoda pada membran diletakkan sejajar pada sisi katoda bak

elektroforesis
Bak elektroforesis di tenagai oleh power supply bertegangan 180 Volt dan dinyalakan

selama 15 menit
Setelah 15 menit membrane selulosa asetat di angkat dari bak elektroforesis dan
diletakkan pada wadah berisi larutan ponceau merah lalu digerak-gerakkan selama 6

menit
10 Setelah 6 menit membrane selulosa asetat diletakkan ke wadah berisi larutan asam asetat
5%
11 Ulangi langkah 10 sekali lagi agar membrane selulosa asetat benar-benar bersih dibilas
12 Mengangkat membrane selulosa dan diangin-anginkan.
VII

Analisis
Pada membrane selulosa asetat yang sudah diberi nomer ( 1 Serum, 2 BSA, 3
Presipitat Globulin 50%, 4 Filtrat Albumin 50%, 5 Filtrat Albumin 100%, Filtrat 100%
No Protein ) tampak. Pada tanda nomer 1 jejak elektroforesis (berwarna merah)
Mengarah ke atas dan kebawah dengan intensitas warna yang hampir sama besar. Ini
menandakan bahwa serum yang secara sama mengarah pada kutub positif (atas
membran) dan kutub negative ( bawah membrane) karena serum tersebut terdiri dari
Globulin dan Albumin. Pada nomer 2 (BSA) senyawa albumin pada sapi,
memperlihatkan jejak elektroforesis mengarah ke kutub positif. Pada jejak nomer 3
terlihat jejak elektroforesis mengarah ke kutub negatif. Jejak elektroforesis nomer 4 dan 5
sama-sama mengarah ke kutub positif (tebal) dengan ketebalan berbeda, sedangkan jejak

elektroforesis nomer 6 tidak memperlihatkan

apa-apa.
VIII

Kesimpulan
Jejak elektroforesis bernomer 2 yang
berisi albumin mengarah ke kutub positif.
Suatu muatan yang mengarah ke kutub
positif pasti bermuatan negative ( gaya Tarikmenarik) dengan demikian sampel yang
memiliki albumin akan mengarah ke kutub
positif karena albumin sendiri bermuatan
negatif. Sedangkan Globulin mengarah ke kutub negatif karena bermuatan positif. Pada
sampel nomer 1 jejak elektroforesis mengarah ke kutub positif maupun negatif, karena
serum terdiri dari albumin yang mengarah keatas (muatan negatif) dan Globulin
mengarah ke bawah (muatan positif). Jejak elektroforesis nomer 6 tidak menghasilkan

IX

apa-apa karena tidak terdapat protein yang dapat dipisahkan.

Referensi
1 Bagian Biokimia FKUI. Biokimia : Eksperimen Laboratorium. Isolasi dan pemisahan
protein. 1st ed. P 35-45. Widya Medika. 2001

Lampiran

Membran selulosa diletakkan pada tatakan

cetakan. (Alat pengepress di sebelah kanan)

Bak elektroforesis yang sudah berisi buffer

barbital (tedapat katoda, anoda)

Plate yang akan di beri sampel 1-6