Pemeriksaan HIV (Human Immunodeficiency Virus) pada Cairan Semen

Menggunakan Metode Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik amplifikasi DNA dengan metode PCR yang
menggunakan dua pasang primer dan menggunakan dua kali reaksi PCR. Reaksi PCR
pertama akan mengamplifikasi darah yang diinginkan dengan sepasang primer sedangkan
reaksi kedua akan mnegamplifikasi produk PCR yang pertama dengan pasangan primer yang
berbeda, dengan menggunakan Neasted PCR, jika terdapat daerah yang salah diamplifikasi
pada reaksi pertama maka dapat dihilangkan dengan reaksi PCR yang kedua. Hasil yang
didapatkan lebih spesifik dan lebih minim kesalahan amplifikasinya dibandingkan dengan
menggunakan PCR biasa.

Diagram Alur:

Mendapatkan Sampel
Cairan Semen

Isolasi Asam
Nukleat

Mempersiapkan Prosedur
larutan Lysate Purifikasi

Sintesis cDNA
dengan reaksi
transkrisi balik

Amplifikasi dengan
Nested PCR

Elektroforesis menggunakan
gel agarosa 1,5 %
Cara kerja:

1. Mendapatkan Sampel Cairan Semen

Pasien diharuskan buang air kecil terlebih dahulu, mencuci tangan dan penis
dengan sabun, mencuci bersih sabun yang menempel lalu mengeringkan tangan dan
penis dengan handuk kering. Selanjutnya pasien mengejakulasikan air mani ke dalam
tabung steril. Pengiriman ke laboratorium dalam waktu ≤ 2 jam pada suhu ruang. Bila
tidak dapat dikirim segera, spesimen dapat disimpan pada suhu ruang dalam waktu ≤
24 jam.
2. Isolasi Asam Nukleat
a. Mempersiapkan larutan Lysate
Sebanyak 25 µl Protein K dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus
kemudian ditambahkan 200 µl plasma dan 200 µl lysis buffer. Tabung
mikrosentrifus ditutup dan larutan didalamnya dicampur menggunakan vortex
selama 15 detik. Tabung diinkubasi pada suhu 56 °C selama 15 menit setelah
itu ditambah 250 µl etanol 100%. Larutan di dalam tabung dicampur
menggunakan vortex selama 15 detik kemudian diinkubasi selama 5 menit
pada suhu ruang.
b. Prosedur Purifikasi
Larutan Lysate dimasukkan ke dalam viral spin column yang berada di
dalam tabung penampung, kemudian di sentrifus dengan kecepatan 6000 rpm
selama satu menit. Cairan di dalam tabung penampung dibuang dan
dipasangkan ke viral spin column lagi untuk dicuci kembali. Setelah dicuci
tabung penampung dilepaskan dari viral spin column dimasukkan ke dalam
tabung tampung baru. Tabung disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm
selama satu mneit kemudian viral spin column dimasukkan ke dalam 1,7 ml
Recovery Tube, lalu tambahkan 50 µl buffer TE pH 8 dimasukkan dan
diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit kemudian disentrifus dengan
kecepatan 14.000 rpm selama satu menit. Hasil purifikasi di dalam recovery
tube bisa langsung digunakan atau disimpan pada suhu -80 °C.
3. Sintesis Cdna Dengan Reaksi Transkripsi Balik
Sintesis cDNA menggunakan kit SuperScript III Frist-Strand Synthesis Super
Mix (Invitrogen). Langkah kerja sesuai dengan protokol pada kit tersebut. Pertama, 6
µl asam nukleat (RNA) dimasukkan ke dalam tabung PCR dan di tambahkan 1 µl
primer random hexamer dan 1 µl buffer annealing. Kedua, tabung PCR diinkubasi
pada suhu 65 °C selama 5 menit kemudian diinkubasi 4 °C selama 1 menit. Ketiga,
tambahkan 10 µl reaction mix dan 2 µl enzim untuk transkripsi balik. Terakhir,
tabung PCR diinkubasi pada suhu 25 °C selama 10 menit, 50 °C selama 50 menit, 85
°C selama 5 menit, dan disimpan dalam suhu 4°C.

4. Amplifikasi dengan Nested PCR

Pembuatan reaksi PCR menggunakan kit Go Taq Green Master Mix
(Promega). Total volume reaksi PCR adalah 25 µl yang terdiri dari: 12,5 µl buffer
reaksi, 1 µl primer forward, 1 µl primer backward, 2,5 µl cetakan cDNA, dan 8 µl
nuclease-free water. Primer yang digunakan pada putaran pertama yaitu primer
forward H1G777 (5’-TCACCTAGAACTTTGAATGCATGGG-3’) dan primer
backward H1P202 (5’-CTAATACTGTATCATCTGCTCCTGT-3’). Ukuran produk
PCR putaran pertama adalah 830 bp. Primer yang digunakan pada putaran kedua yaitu
primer forward H1Gag1584 (5’-AAAGATGGATAATCCTGGG-3’) dan primer
backward g17 (5’-TCCACATTTCCAACAGCCCTTTTT-3’). Ukuran produk PCR
putaran kedua adalah 460 bp. Tahapan siklus Nested PCR dicantumkan dalam tabel
dibawah ini :

Tabel 1. Tahapan siklus Nested PCR putaran pertama

Tahapan Suhu Waktu Siklus

Denaturasi awal 95 °C 2 menit 1 siklus
Denaturasi 95 °C 1 menit 35 siklus
Annealing 45 °C 1 menit 35 siklus
Elongasi 72 °C 1 menit 35 siklus
Elongasi akhir 72 °C 1 menit 1 siklus
Final hold 4 °C 5 menit
 Tabel 2. Tahapan siklus Nested PCR putaran kedua

Tahapan Suhu Waktu Siklus

Denaturasi awal 95 °C 2 menit 1 siklus
Denaturasi 95 °C 1 menit 35 siklus
Annealing 45 °C 1 menit 35 siklus
Elongasi 72 °C 1 menit 35 siklus
Elongasi akhir 72 °C 5 menit 1 siklus
Final hold 4 °C

5. Elektroforesis menggunakan media gel agarosa 1,5 %

Mula-mula tiga gram agarosa dimasukkan ke dalam glass beaker dan
ditambahkan buffer TAE 1x sampai 200 ml. Agarosa dicairkan dengan menggunakan
autoclave kemudian dicampur dengan magnetic stirrer dalam keadaan panas. Sambil
didinginkan sampai 55 °C, EtBr ditambahkan sampai konsentrasi 0,5 µg/ml dan
diaduk dengan magnetic stirrer. Selanjutnya cairan dituangkan kedalam cetakan gel
yang sudah dipasangi sisir dan dibiarkan dalam suhu kamar selama 15-20 menit
sampai menjadi padat. Setelah padat sisir diambil dan gel diletakkan pada bak
elektroforesis. Gel digenangi (sampai cukup tergenang) dengan buffer TAE 1x.
Terakhir, tambahkan 5 µl Loading quickλHind III digest, DNA-110 (toyobo)
dimasukkan ke dalam sumur pertama dan 5 µl Loading quick xi74/Hae III digest,
DNA-112 (toyobo) dimasukkan ke dalam sumur kedua, dilanjutkan 2.5 µl produk
Nested PCR ke dalam sumur berikutnya secara urut sesuai nomor sampel. Setelah
semua sampel dimasukkan, mesin elektroforesis disetel 100 Volt selama 30 menit
kemudian dinyalakan.

NAMA : NAADIYAH PUTRI UTAMI

NIM : 151710113015