MAKALAH KIMIA KLINIK 1

“Penentuan kalsium dalam Plasma EDTA dengan Metode

Kolorimetri dam format pembacaan lempeng mikro”

Disusun oleh :
1. Rahma Putri M Wies Hanif 151710113002
2. Alda Nugrahini Lailani 151710113012
3. Naadiyah Putri Utami 151710113015
4. Danilla Ramadhina Divaniary 151710113045

PROGRAM STUDI D3 ANALIS MEDIS

FAKULTAS VOKASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2018
 DAFTAR ISI

Cover
Daftar Isi................................................................................................................... i
Kata Pengantar ........................................................................................................ ii
BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1
A. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 1
B. Latar Belakang ............................................................................................ 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN DASAR TEORI........................................ 3

2.1. Pengertian Kalsium ..................................................................................... 5

2.2. Pengertian EDTA ........................................................................................ 7

2.3. Pengertian Plasma ....................................................................................... 8

2.4. Metode Kolorimetri ..................................................................................... 9

BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN ............................................... 11

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 13

A. Hasil .......................................................................................................... 13
B. Pembahasan ............................................................................................... 14

BAB V KESIMPULAN ........................................................................................ 17

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 18

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan atas kehadiran Tuhan Yang Maha Esa
merupakan suatu keharusan, karena berkat rahmat dan Karunia-Nya lah sehingga
tim penyusun mampu menyelesaikan makalah yang sederhana ini sebagaimana
waktu yang telah ditentukan. Karya tulis ini berjudul “Calsium Determination in
EDTA Treated Plasma by Colorimetric Method and Microplate Reading Format”
karya tulis ini merupakan hasil bedah jurnal karya S. Adeleh Razavi, Laleh
Hoghooghirad, Hoda Golab-Ghadaksaz, Mehdi Hedayati. Karya tulis ini
terbentuk sebab adanya koordinasi yang baik dari berbagai elemen, termasuk
dosen pembingbing mata kuliah Kimia Klinik Ibu Ni Nyoman
Purwani,S.Si.,M.Si. serta ibu Anita Kurniati, S.Si.,M.Si. oleh karenanya kami
ucapkan terimakasih. Dimana penulisan makalah ini, tersirat harapan dari kami
yaitu semoga mampu memberikan pengetahuan yang benar berkaitan dengan cara
penyusunan makalah secara tepat.
Suatu kebanggan bagi kami manakala makalah ini mampu memberikan
manfaat yang signifikan, baik untuk penulis maupun pembaca. Demikian kata
pengantar yang dapat kami sampaikan, dan kami sangat menyadari bahwa apa
yang kami buat masih tergolong kurang lengkap. Hal itu disebabkan keterbatasan
pengetahuan, waktu, dan sumber bacaan. Kami sangat mengharapkan masukan-
masukan dari pembaca yang bersifat membangun untuk kami jadikan rujukan
dalam penulisan karya ilmiah selanjutnya.

Surabaya, 10 Oktober 2018

Tim Penyusun

ii
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Tujuan penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji keakuratan
pemeriksaan kalsium metode o-CPC dengan menggunakan sampel plasma
EDTA yang lebih murah jika dibandingkan dengan antikoagulan heparin.

B. Latar Belakang
Kalsium adalah mineral paling penting dalam tubuh manusia. Serta
peran struktural pada gigi dan tulang, memiliki fungsi fisiologis penting
seperti kontraksi otot, eksitasi saraf, pembekuan darah, sekresi, pemupukan,
aktivasi enzim, proliferasi, ekspresi gen dan apoptosis. Ada tiga bentuk
kalsium dalam plasma: ion kalsium bebas, mengikat protein seperti albumin
dan mengikat molekul anion kecil seperti fosfat, bikarbonat, dan sitrat.
Kekurangan asupan kalsium dalam tubuh manusia menyebabkan
abnormalitas metabolisme terutama pada usia dini, gangguan pertumbuhan
seperti tulang kurang kuat, mudah bengkok, dan rapuh. Pada orang dewasa
dengan usia di atas 50 tahun, akan kehilangan kalsium dari tulangnya
sehingga menjadi rapuh dan mudah patah yang dikenal sebagai osteoporosis
(Ensminger et al. 1995). Namun, bila kelebihan kalsium juga dapat beresiko
terhadap tubuh seperti menyebabkan batu ginjal, kanker prostat, sulit buang
air besar (konstipasi) dan penumpukan kalsium di pembuluh darah (Winarno,
1982). Karena kalsium sangat penting bagi fisiologis tubuh maka, mengukur
kadar serum kalsium adalah permintaan harian dokter dan mengacu pada
laboratorium medis.

Biasanya beberapa tes seperti hitung darah lengkap (CBC) dan

pengukuran glukosa plasma membutuhkan sampel plasma. Antikoagulan
yang paling umum untuk mendapatkan plasma adalah Ethylene Diamine
Tetra Acetic Acid (EDTA). Karena kurangnya uji kalsium pada sampel

1
plasma yang mengandung EDTA, laboratorium harus menyediakan sampel
serum untuk pengukuran kalsium. Metode konvensional untuk mengukur
kalsium darah meliputi metode Clark-Colip yang merupakan metode tertua
dan melibatkan prosedur rumit seperti pengendapan kalsium sebagai oksalat,
pemisahan oksalat diendapkan oleh filtrasi, pelepasan ion oksalat dalam
larutan H2SO4 panas, dan titrasi oksalat dengan kalium permanganat. Metode
standar ini biasanya digunakan untuk memeriksa keakuratan metode lain.
Kompleksometri atau metode titrasi kalsium dengan EDTA adalah yang cepat
dan akurat tetapi pengakuan titik akhir titrasi sulit.

Berbagai tes enzimatik telah dilaporkan tetapi mereka memiliki

keterbatasan karena ketidakstabilan reaktan mereka. Metode seperti serapan
atom spektrometri (AAS), elektroda selektif ion (ISE), kromatografi ion,
resonansi magnetik nuklir (NMR), kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC),
elektroforesis kapiler adalah metode analitik yang sensitif tetapi canggih dan
prosedurnya termasuk langkah ekstraksi atau persiapan yang membosankan
dan tidak praktis. Selain itu, biaya instrumen ini tinggi. Saat ini metode yang
paling umum untuk mengukur kadar kalsium di laboratorium klinis adalah
metode spektrofotometri menggunakan Ortho cresolphthalein complexone (o-
CPC).

Batasan paling penting dari o-CPC adalah ketidakmampuannya

dalam mengukur kalsium dalam plasma EDTA karena EDTA dengan ion
kalsium membentuk kompleks yang stabil. Jadi, untuk mengukur kalsium
dengan reagen ini, sangat ditekankan untuk tidak menggunakannya EDTA
plasma. Karena belum dilaporkan metode laboratorium rutin untuk mengukur
kadar kalsium dalam sampel plasma EDTA, kebutuhan untuk melakukan
penelitian semacam itu ditemukan. Oleh karena itu (Razavi Et Al., 2013)
melakukan penelitian yang baru dipatenkan dan telah disajikan. Penelitian ini
dapat mengukur kalsium dalam plasma yang diolah EDTA dengan metode o-
CPC.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA DAN LANDASAN TEORI

Setelah melakukan telaah terhadap penelitian sebelumnya, kami

menemukan beberapa penelitian yang memiliki kesamaan dengan penelitian
yang kita ambil. Salah satunya adalah penelitian dari Eisaku Hokazono tahun
2009 dengan judul “Development of a new measurement method for serum
calcium with chlorophosphonazo-III”. Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk menemukan metode terbaru yang lebih stabil jika dibandingkan dengan
metode o-CPC. Tujuan dari penelitian ini didasari oleh banyaknya metode
yang digunakan di laboratorium untuk mengukur kalsium dalam cairan tubuh
di antaranya, spektrofotometri serapan atom (AAS). Merupakan metode yang
paling dapat diandalkan, tetapi membutuhkan instrumen khusus dan mahal,
sehingga tidak cocok untuk uji rutin dilaboratorium klinis. Pendekatan yang
paling banyak digunakan adalah metode kolorimetri, yang menggunakan
chelators seperti o-cresolphthalein complexone (oCPC), 3–5 methylxylenol
blue (MXB) 6 dan arsenazo-III (AZ-III). Awalnya, metode oCPC disajikan
masalah stabilitas reagen, linearitas dan pemulihan karena magnesium
mengganggu reaksi. Metode yang banyak digunakan kemudian ditingkatkan
oleh Kessler dan Wolfman, yang membuatnya lebih spesifik untuk kalsium
melalui penambahan 8-hydroxyquinoline untuk menutupi magnesium yang
ada. Namun, metode ini tidak sepenuhnya memuaskan dalam hal pemulihan
pada konsentrasi rendah dan ketidakstabilan yang disebabkan oleh alkalin
pereaksi sedang.

Selain itu, metode MXB memberikan stabilitas yang tidak

memuaskan karena media alkalin. Dari perspektif itu, metode AZ-III dan
CPZ-III memberikan stabilitas yang memuaskan karena reaksinya dalam
medium netral atau asam. Namun demikian, yang pertama mencakup jejak
arsenik dalam strukturnya. Oleh karena itu, efeknya terhadap lingkungan
dipertanyakan. Selanjutnya, meskipun memberikan akurasi tinggi, metode
enzimatik menggunakan pankreas a-amilase9 atau fosfolipase sangat mahal,

3
bahkan pada basis per-tes. Pada penelitian ini melaporkan metode asli,
sensitif dan spesifik untuk kalsium serum menggunakan CPZ-III
(chlorophosphonazo-III) bereaksi dalam media asam tidak menggunakan
logam berat.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spesimen serum

dikumpulkan dari pasien rawat inap dan pasien rawat jalan Rumah Sakit
Universitas Kyushu setelah menerima penjelasan dan persetujuan mereka dari
komite etika institusi penelitian. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini
adalah zat ini dapat digunakan sebagai reagen untuk pemeriksaan kalsium dan
magnesium dalam medium netral. Namun demikian, ia bereaksi unik
terhadap kalsium dalam medium asam (pH 2,2), absorbsi molar kompleks
CPZ-III dengan kalsium pada pH 2.2 adalah 14.600 / L / mol / cm. Molar
absortivitasnya 16,300 / L / mol / cm.templas absorptivitas kompleks CPZ-III
dengan magnesium pada larutan netral adalah sekitar 15.000 / L / mol / cm.
Namun, pada pH kurang dari 6.0, magnesium bereaksi sangat sedikit dengan
CPZ-III. Oleh karena itu, peneliti memeriksa pH buffer, yang berguna untuk
mengukur kalsium secara spesifik dalam medium yang lebih asam jika buffer
tidak dipengaruhi oleh protein. PH buffer ditentukan sebagai 5,0.

Penyerapan kompleks CPZ-III dengan kalsium sangat kuat pada

panjang gelombang kurang dari 650 nm. Oleh karena itu, komposisi reagen
ditentukan saat mempertimbangkan rentang pengukuran yang memadai.
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, uji kemampuan reproduksi, presisi,
dan pemulihan dari metode kami bagus. Selanjutnya, karena linearitas meluas
hingga 7,0 mmol / L, Eisaku menganggap bahwa spesimen urin dapat diuji
tanpa pengenceran. Dalam percobaan untuk menilai interferensi oleh
substansi, Eisaku menunjukkan bahwa metode yang disajikan tidak
terpengaruh dengan mudah oleh logam (Mg2+, Fe2+, Cu2+ dan Zn2+) dan zat
interferen in vivo yang diulas saat ini.

4
 Untuk antikoagulan EDTA, metode yang dipresentasikan sedikit
menurun. Namun, konsentrasi EDTA yang digunakan untuk pengambilan
sampel darah biasa 1,0 g / L. Sebenarnya, dalam kasus 1,2 g / L EDTA,
metode yang dipresentasikan hanya berkurang 1,8% untuk nilai yang
diharapkan. Oleh karena itu, diperkirakan bahwa sebagian besar pengaruh
tidak hadir untuk antikoagulan EDTA. Namun, dalam metode oCPC, itu tidak
dapat diukur sama sekali. Diperkirakan bahwa karena reagen yang digunakan
bereaksi dalam asam, tindakan chelator itu sendiri melemah dalam medium
untuk kalsium EDTA. Selain itu, dalam uji stabilitas reagen, reagen kami
menggunakan CPZ-III stabil selama 20 hari pada 48C° tanpa kalibrasi harian.
Di sisi lain, metode oCPC menurunkan nilai serum kontrol secara dramatis.
Peneliti menyimpulkan bahwa pH buffer diubah karena reagen alkali medium
dengan metode oCPC menyerap bikarbonat dari atmosfer.

Penelitian diatas memiliki persamaan dengan penelitian yang peneliti

lakukan yaitu mengenai tema yang diteliti yakni sama-sama meneliti tentang
pemeriksaan kalsium dengan metode oCPC. Sedangkan perbedaannya yaitu
mengenai objek dan tempat yang diteliti dan juga tujuan dari penelitian.
Penelitian yang dilakukan peneliti lebih fokus kepada penemuan larutan
pengencer yang dapat mengurangi terbentuknya kompleks ion stabil antara
EDTA dengan kalsium yang akan membuat hasil menjadi rendah palsu.
sedangkan pada penelitian yang dilakukan oleh Eisaku Hokazono lebih
menekan kan pada penggunaan reagen CPZ III dalam metode oCPC.

2.1. Pengertian Kalsium

Kalsium merupakan unsur terbanyak kelima dan kation
terbanyak dalam tubuh manusia, terdapat dalam jumlah 1,5-2 % dari
keseluruhan berat tubuh. Lebih dari 99 % kalsium terdapat dalam tulang.
Dalam tulang ini perbandingan antara kalsium dan fosfor hampir selalu
tetap dan sedikit lebih besar daripada 2:130. Hasil penelitian para pakar
menunjukkan bahwa tubuh manusia mengandung sekitar 22 gr

5
kalsium/kg berat adannya tanpa lemak. Dari jumlah itu sekitar 99 % Ca
terdapat dalam tulang dan gigi.
Tulang tidak saja berfungsi sebagai komponen struktur ataupun
komponen penunjang tubuh tetapi juga merupakan jaringan fisiologis
yang utama bagi pengadaan kalsium untuk control haemostatic
(menghentikan pendarahan). Selama hidup, tulang mengalami perubahan-
perubahan melalui proses resorpsi dan pembentukan yang berlangsung
terus menerus.
Tersedianya Ca dalam tubuh berasal dari beberapa bahan
makanan sebagai sumbernya seperti susu, kuning telur, keju, mentega,
udang, sayuran, kacangkacangan, buah-buahan. Selanjutnya unsur
disimpan dalam jaringan spons tulang. Dalam penggunaannya diatur oleh
kalenjer anak gondok/ parathermon.
Tubuh memerlukan kalsium selama hidup, terutama pada masa
kanakkanak, masa mengandung dan laktasi. Unsur ini sering kali terdapat
dalam kadar yang kurang memadai dalam diri seorang. Kadar kalsium
mencapai jumlah 39 % dari seluruh mineral yang ada dalam tubuh dan 99
% kalsium tersebut berada dalam jaringan keras, tulang dan gigi. Yang 1
% berada dalam darah, airan diluar sel dan dalam sel jaringan lunak
dimana kalsium mengatur berbagai funsi metabolik yang penting. Pada
anak-anak sintesis tulang lebih besar daripada destruksi tulang, sedangkan
pada orang dewasa normal terdapat keseimbangan dinamik mineral
kalsium antara tulang dan cairan tubuh
Didalam tubuh orang dewasa`terdapat sekitar 1.200 gr kalsium,
yang hampir semuanya (99 % ) terdapat dalam skeleton. Skeleton ini
terdiri dari 2 bentuk yaitu trabekular dan kortikal. Proses puncak
pembentukan masa tulang terjadi hingga usia 35-40 tahun dan turn over
Ca tulang terjadi sepanjang hidup, yang meliputi proses formasi dan
resorbsi. Sisa 1 % Ca dalam tubuh terdapat pada cairan ekstraseluler,
struktur intraseluler dan membran sel. Meski dalam jumlah sedikit tapi Ca
diluar tulang berperan cukup penting yaitu untuk sistem syaraf, kontraksi
otot, pembekuan darah dan permebiliatas membran. (Rahmadani: 2011)

6
2.2. Pengertian EDTA
EDTA digunakan sebagai zat penopeng pada analisis kalsium
yang mengandung fosfat dengan metode spektrofotometri serapan atom.
Fosfat dan kalsium membentuk senyawa refractory sehingga terhalangi
pembentukan atom-atom kalsium pada saat atomisasi. Penelitian ini
bertujuan menentukan penambahan EDTA yang minimum
diperlukan sebagai zat penopeng. Hasil penelitian menunjukkan EDTA
700 ppm pada pengukuran kalsium 5 ppm dapat mengurangi gangguan
fosfat 5 ppm, sedangkan EDTA 7000 ppm pada pengukuran kalsium 5
ppm dapat mengurangi gangguan fosfat 50 ppm. Sementara asam p-t-
butilkaliks[4]arena-tetrakarboksilat 30 ppm dapat mengurangi gangguan
fosfat 5 ppm sedangkan asam p-t-butilkaliks[4]arena-tetrakarboksilat 70
ppm dapat mengurangi gangguan fosfat 10 ppm.

Tergantung pada kemampuan kompleks yang terbentuk, EDTA

bereaksi dengan ion logam yang berbeda-beda pada harga pH yang
berbeda-beda pula. Ion-ion logam yang membentuk kompleks dapat
bereaksi dengan EDTA dalam larutan yang bersifat asam (Salimin
dan Gunandjar, 2006).

Bila Protective agent yaitu EDTA ditambahkan ke dalam

larutan yang mengandung ion logam maka senyawa kompleks akan
terbentuk. Senyawa kompleks tersebut mempunyai nilai stabilitas
tertentu, yang dinyatakan dalam konstanta stabilitas kation yang
terkomplekkan. Bila ada dua atau lebih ion logam dalam larutan
sebagaimana yang terjadi pada air alam, terdapat reaksi kompetisi
terhadap protective agent. Reaksi pembentukan senyawa kompleks
antara ion logam dan protective agent merupakan reaksi setimbang,
dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain pH, temperatur, jenis dan
konsentrasi padatan terlarut, dan lain-lain. Misalnya penambahan EDTA
akan dapat mengatasi gangguan fosfat karena EDTA akan bereaksi

7
 dengan kalsium (EDTA harus juga ditambahkan pada larutan standar)
(Salimin dan Gunandjar, 2006).

Saat ini belum ditemukan literatur yang memberikan

penjelasan secara terperinci mengenai berapa banyak penambahan EDTA
yang optimum sehingga kalsium dapat dianalisis dengan
akurat. (Natalia)

2.3. Pengertian Plasma

Plasma darah adalah organ tubuh bagian dari darah yang memiliki
fungsi sangat strategis untuk kesehatan dan kebaikan tubuh manusia. Dari
segi fungsinya, bagian dari sistem peredaran ini memiliki kegunaan yang
bila terjadi gangguan dapat mengakibatkan penyakit peredaran
darah yang serius dan sangat fatal akibatnya. Kesehatannya perlu kita
jaga, tidak boleh dianggap sepele ya. Karena sekali terjadi gangguan bisa
menyebabkan efek yang bisa menjadikan penderitanya sakit sangat
kompleks. Bagian plasma darah yang mempunyai fungsi penting dalah
serum, serum ini dikelaurkan dipisahkan oleh fribrinogennya. Berwarna
cerah dan jernih dan mengandung antibodi untuk menghancurkan protein
asing yang masuk ke dalam tubuh. Di dalam plasma darah sendiri
merupakan zat penting yang sangat dibutuhkan untuk metabolisme
organisme tubuh untuk keberlangsungan sistem peredarah tubuh yang
optimal. Dalam kandungan plasma darah berisi dari sari-sari makanan, zat
penting nutrisi, oksigen, albumin, protein, hormon-hormon yang sangat
krusial untuk sirkulasi tubuh.

Plasma ialah cairan darah ( 55 % ) sebagian besar terdiri dari

air ( 95%), 7% protein, 1% nutrien . Didalam plasma terdapat sel-sel
darah dan lempingan darah, Albumin dan Gamma globulin yang berguna
untuk mempertahankan tekanan osmotik koloid, dan gamma globulin
juga mengandung antibodi ( imunoglobulin ) seperti IgM, IgG, IgA, IgD,
IgE untuk mempertahankan tubuh terhadap mikroorganisme. Didalam

8
 plasma juga terdapat zat/faktor-faktor pembeku darah, komplemen,
haptoglobin, transferin, feritin, seruloplasmin, kinina, enzym, polipeptida,
glukosa, asam amino, lipida, berbagai mineral, dan metabolit, hormon
dan vitamin vitamin.

Mineral-mineral di dalam plasma darah terdapat dalam bentuk

garam mineral. Fungsi garam mineral ialah untuk mengatur tekanan
osmotik dan PH darah. Protein yang terdapat dalam darah (protein darah)
terdiri atas albumin, globulin, dan fibrinogen. Albumin berperan dalam
pengaturan tekanan darah. Globulin biasanya dikenal sebagai
imunoglobulin berfungsi membentuk benang-benang fibrin. Benang-
benang fibrin berperan penting dalam proses pembekuan darah saat tubuh
kita terluka. jika larutan protein dalam plasma darah diendapkan dengna
sentrifuge (alat pemutar), akan tertinggal cairan berwarna kuning
jernih yang disebut serum. Serum mengandung antibodi yang dapat
melawan zat/benda asing atau kuman yang masuk ke dalam tubuh. Zat
asing yang masuk ke dalam tubuh dikatakan sebagai antigen. Antibodi
yang dapat menggumpalkan antigen disebut presipitin ; yang dapat
menguraikan antigen disebut lisin ; dan yang dapat menawarkan racun
disebut antioksin.

2.4. Metode Kolorimetri

Kolorimetri adalah metode perbandingan menggunakan
perbedaan warna. Metode kolorimetri mengukur warna suatu zat sebagai
perbandingan. Biasanya cahaya putih digunakan sebagai sumber cahaya
untuk membandingkan absorpsi cahaya relatif terhadap suatu zat. Salah
satu alat yang digunakan untuk mengukur perbandingan warna yang
tampak adalah kolorimeter. Selain kolorimetri, metode lain yang
menggunakan warna sebagai pembanding adalah spektofotometri.
Kelebihan metode kolorimetri adalah kemudahannya dalam menetapkan
kuantitas zat yang sangat kecil. Metode kolorimetri biasa digunakan
dalam analisis kimia. Metode kolorimetri memiliki batas atas pada

9
 penetapan konstituen yang ada dalam kuantitas yang kurang dari satu atau
dua persen.Salah satu faktor utama dalam metode kolorimetri adalah
intensitas warna yang harus proporsional dengan konsentrasinya. Alat
kolorimetri yang menggunakan sensor atau sel fotolistrik disebut
kolorimetri fotolistrik. Kolorimetri fotolistrik digunakan sebagai
pengurangan sesatan yang disebabkan oleh pribadi pengamat.Kolorimetri
fotolistrik menggunakan prinsip panjang gelombang cahaya
menggunakan filter yang berbentuk lempengan. Filter dalam kolorimetri
fotolistrik terbuat dari berbagai macam bahan, antara
lain kaca dan gelatin.

Metode Kolorimetri merupakan bagian dari metode

spektroskopi sinar tampak yang berdasarkan pada panjang sinar tampak
oleh suatu larutan berwarna, hanya senyawa yang dapat ditentukan
dengan metode spektroskopi, senyawa yang tidak berwarna dapat dibuat
menjadi berwarna, seperti ion Fe3+ dan SCN- menghasilkan larutan
berwarna merah.

Kolorimetri dilakukan dengan membandingkan larutan standar

dengan aplikasi yang dibuat pada keadaan yang sama dengan
menggunakan tabung Nessler atau kolorimeter Dubosque. Dengan
kolorimetri elektronik, jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus
dengan konsentrasi larutan. Metode ini sering digunakan dalam
menentukan konsentrasi besi dalam air minum.

Gambar 2.4.1. kiri adalah gambar alat spektofotometer. Kanan gambar

cara kerja alat spektrofotometer

10
 BAB III
BAHAN DAN METODE PENELITIAN

Dalam penelitian eksperimental ini sekitar 4 mL darah diambil dari 40

sukarelawan yang sehat. Setiap sampel dibagi menjadi dua alikuot (2 mL untuk
persiapan serum dan 2 mL untuk persiapan plasma). Untuk persiapan plasma,
menggunakan tabung yang berisi EDTA. Sampel dikumpulkan dalam tabung dan
disimpan dalam microtube tanpa kalsium. Untuk mencegah permukaan
evaporasi, tutup microtubes dengan benar. Sampel disimpan pada suhu 2-8ºC
dan untuk periode yang lebih lama mereka disimpan pada -20 ° C hingga
pengujian dilakukan. Semua bahan kimia dibeli dari Merck, Jerman.

Untuk penentuan kalsium pada 10 µL plasma sebagai sampel, standar

sebagai kalibrator dan aquades sebagai blanko, ditambahkan ke sumuran
microplate sebanyak 96 sumur. Larutan standar kalsium (10,5 mg / dL) dibeli dari
Pars Azmoun Co., Tehran, Iran. Solusi dari X telah disiapkan. (X adalah solusi
yang dipatenkan yang dapat memisahkan dan melepaskan kalsium dari EDTA. Ini
ditetapkan pada 29.04.2012 oleh Badan untuk Pendaftaran Perbuatan dan Properti
dengan nomor registrasi 74, 804, dan merupakan properti eksklusif untuk
pemilik). Kemudian 10 µL X larutan ditambahkan ke sumur yang mengandung
plasma dan blanko. Untuk memiliki volume yang sama, 10 µL aquades
ditambahkan ke solusi standar. Selama 15 menit, lempeng mikro ditempatkan
pada pengocok lempeng (Stat Fax-2200, Teknologi Penyadaran, Inc.,
USA). Empat bagian larutan etanolamin, 0,8 M / L, pH = 10,7, dan satu bagian
solusi yang mengandung o-CPC, 0,06 mM, 8-hydroxyquinoline, 7 mM dan asam
hidroklorik, 20 mM, pH = 1,1 untuk membuat larutan homogen dicampur.
Kemudian 300 µL larutan homogen ditambahkan semua sumur mengandung
plasma, standar dan blanko. Akhirnya, setelah 5 menit absorbansi diukur pada 578
nm dengan pembaca lempeng (Sun Rise, TECAN A-5082, TECAN Groups Ltd.,
Salzburg, Austria).

11
 Validitas metode telah dievaluasi sebagai berikut: Presisi metode dinilai
oleh intra dan koefisien antar-variasi variasi untuk tiga sampel dengan kandungan
kalsium rendah, sedang, dan tinggi. Nomor replikasi adalah delapan dalam semua
langkah. Sensitivitas metode dihitung berdasarkan rata-rata optik kepadatan
standar nol ditambah dua kali standar deviasi. Untuk mengevaluasi akurasi
berdasarkan paralelisme pengujian, sampel dilarutkan secara berurutan dengan
distilasi ganda air. Menggunakan data yang diharapkan dan terukur, rasionya
persentase tes paralelisme ditentukan. Juga Tes pemulihan ditentukan dengan
menambahkan 10 µL standar solusi menjadi tiga sampel dengan konsentrasi
berbeda. Kemudian menggunakan data yang diharapkan dan terukur, pemulihan
persen dihitung. Untuk membandingkan dua metode, diperoleh hasil metode baru
ini dalam sampel plasma dibandingkan dengan metode kolorimetri o-CPC di
sampel serum yang sama dan koefisien korelasi dihitung.

Gambar 3.1. Gambar Microplate reader yang terdiri dari 96 sumuran

12
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Setelah studi teoritis dan uji coba, X dipilih sebagai perpindahan ion
kalsium dari EDTA sebagai chelators. Konsentrasi yang tepat dan volume X
dan yang dibutuhkan waktu untuk melepaskan kalsium dari kompleks EDTA-
Ca dioptimalkan. Tabel 1 berisi data inter / intra pengujian kadar
logam. Seperti yang ditunjukkan oleh temuan, ketepatan metode bisa
diterima.

Tabel 1. Hasil penilaian presisi, intra dan interassay koefisien

Berdasarkan rata-rata penyerapan standar nol plus dua kali deviasi

standar, sensitivitasnya dihitung 0,4 mg / dL Hasil tes paralelisme dan
pemulihan disajikan dalam tabel 2 dan 3. Tabel-tabel ini menunjukkan bahwa
metode memiliki ketepatan yang dapat diterima. Gambar 1 berisi hasil
perbandingan metode.

Tabel 2. Hasil uji paralelisme untuk penilaian akurasi

13
 Tabel 3. Hasil tes pemulihan untuk penilaian akurasi

Gambar 1. Perbandingan hasil uji baru untuk kalsium plasma dengan

kadar kalsium serum (N = 40)

B. Pembahasan
Menurut data yang dikumpulkan dalam penelitian ini, solusi X yang
dipatenkan, dapat memisahkan dan melepaskan ion kalsium dari chelator
EDTA dan memberikan kemungkinan mengukur konsentrasi kalsium dalam
plasma EDTA. Karena belum dilaporkan adanya pemeriksaan rutin untuk
penentuan kalsium dalam plasma yang diobati EDTA, evaluasi komparatif
dari metode yang dipatenkan tidak mungkin dilakukan. Oleh karena itu, dasar
ilmiah dari solusi yang dipatenkan, efisiensi dan kelebihannya dibandingkan
dengan metode lain yang dibahas. Dalam EDTA diobati plasma, kalsium

14
sangat chelated oleh EDTA dan tidak terkena o-CPC, karena EDTA memiliki
kecenderungan tinggi untuk membentuk kompleks dengan ion kalsium. Dasar
ilmiah dari metode baru ini dibentuk menggunakan pemindah. Dengan
demikian, jika pemindahan yang memiliki kecenderungan lebih besar untuk
EDTA ditambahkan ke plasma EDTA, Ca dilepaskan oleh penggantian.
Setelah pelepasan ion kalsium, mereka dapat ditentukan oleh pereaksi o-CPC.
Meskipun pentingnya kalsium dalam berbagai proses metabolisme, tidak ada
metode untuk penentuan kalsium dalam plasma. Selain itu banyak metode
untuk penentuan kalsium membutuhkan instrumen analitis yang tidak tepat
untuk laboratorium klinis karena biaya tinggi, personil berpengalaman yang
tinggi dan tingkat pengukuran yang rendah. Namun, metode ini memiliki
akurasi yang tinggi dan dianggap sebagai metode referensi. Jadi metode
sederhana dan murah diperlukan.

Metode kolorimetri untuk penentuan kalsium oleh o-CPC reagen

karena kesederhanaan, sensitivitas dan efisiensi, adalah umum. Tetapi metode
ini terbatas pada penggunaan sampel plasma urin, serum dan heparin. Heparin
lebih mahal daripada reagen antikoagulan lainnya (misalnya EDTA) dan
efeknya bersifat sementara. Heparin tidak menghentikan pembekuan darah
dan hanya menunda proses selama 8 hingga 12 jam. Jadi, antikoagulan yang
paling umum adalah EDTA. Jadi menurut metode o-CPC, laboratorium harus
mengambil serum dan plasma, 2 jenis sampel dari pasien yang membutuhkan
hitung darah lengkap (EDTA diobati darah) dan serum kalsium. Karena
alasan tersebut, upaya dimulai untuk menghilangkan keterbatasan metode o-
CPC dan akhirnya mengarah untuk mengembangkan metode baru untuk
mengukur kalsium dalam sampel EDTA yang dipatenkan pada 29.04.2012 di
Organisasi Negara untuk Pendaftaran Perbuatan dan Properti dengan nomor
registrasi 74804. Secara umum, memecahkan
keterbatasan

Keterbatasan metode umum penentuan kalsium meningkatkan

parameter metodologis dan memperluas jangkauan ilmu terapan di bidang ini.

15
Keuntungan lain dari metode ini adalah kalsium dapat diukur dalam plasma
dan serum secara bersamaan. Dengan demikian, biaya laboratorium
berkurang. Ketiga, metode ini adalah metode sederhana yang dapat langsung
mengukur kalsium. Juga format bacaan mikro meningkatkan kecepatan waktu
pengujian dan mempersingkat waktu uji total. Hasil yang diperoleh dari
metode baru ini dalam sampel plasma seharusnya telah dibandingkan dengan
metode lain yang menentukan kadar kalsium dalam sampel plasma EDTA,
tetapi seperti yang disebutkan sebelumnya metode yang dilaporkan untuk
penentuan kalsium telah digunakan sampel serum bukan plasma. Karena
perbedaan antara plasma dan kalsium serum rendah dan tidak mungkin untuk
menentukan kadar kalsium plasma EDTA, sehingga mereka memperoleh
hasil dari metode baru dibandingkan dengan sampel serum identik.
Kesimpulan akhir dari penelitian ini adalah metode yang diusulkan untuk
mengukur kadar kalsium dalam plasma EDTA memiliki sensitivitas, presisi
dan akurasi yang dapat diterima. Menurut metode ini, keterbatasan metode
kolorimetrik untuk penentuan kalsium plasma EDTA oleh pereaksi o-CPC
diselesaikan. Karena sebagian besar laboratorium klinis menggunakan analisa
otomatis untuk analisis biokimia dan pengukuran, disarankan untuk
mempelajari kemungkinan menyesuaikan metode baru ini pada instrumen
otomatis umum.

16
 BAB V
KESIMPULAN

Kesimpulan dari penelitian ini adalah Metode ini mampu mengukur

kalsium dalam plasma yang diobati EDTA dan selain itu, ia memiliki kepekaan,
presisi dan akurasi yang diperlukan untuk tes klinis umum.

17
 BAB VI
DAFTAR PUSTAKA

Hokazono, Eisaku., Susumu Osawa, Tomota Nakano.,Yukari Kawamoto., Yuji

Oguchi.,Taeko Hotta., Yuzo Kayamori., Dongchon Kang., Yuichiro
Cho., Kiyoko Shiba., Kenji Sato. 2009. Development of a new
Measurement Method forSerum Calsiumwith Chlorophosphonazo-III.
Ann Clin Biochem 2009; 46: 296-301.

Rahmadani, Sri. 2011. Penentuan Kadar Kalsium dengan Metode

Permanganometri Terhadap Tempe yang Dibungkus Plastik dan Daun
di Pasar Arengka Pekanbaru. Fakultas Tarbiyah dan Keguruan
Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau Pekanbaru

Schales, Otto dan Selma S. Schales. 1941. A Simple and Accurate Method for
Determination of Electrolyte in Biological Fluids. Boston : Harvard
Medical School.

18