Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Jumat/20 Oktober-

Enzimologi 17 November 2017

Waktu : 08.00-11.00 WIB
PJP : Ukhradiya Magharaniq
Asisten : Shofiyyatunnisa
Auliya Cahya Ningrum
Faricha Eka Ariani
M. Maftuchin Sholeh

PENGARUH pH, SUHU DAN KESTABILAN ENZIM

TERHADAP AKTIVITAS ALFA AMILASE S Cerevisae
Kelompok 20
Krisdianty G84150032
Fatmawati G84120029
Felix Martine G84150065
Muhammad Alfian Prasetyo G84040090

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2017
 PENDAHULUAN

Enzim alfa-amilase (endo-α-1,4-glucan glucanohydrolase) merupakan

endo-enzim yang bekerja spesifik untuk memotong ikatan α-1.4 glikosidik secara
acak baik mulai dari ikatan yang berada di bagian tengah atau di dalam rantai
polimer. Alfa amilase memiliki kecepatan kerja yang tinggi dalam menghidrolisis
substrat. Laju kerja enzim amilase lebih cepat dibandingkan dengan enzim
penghidrolisis pati lainnya. Enzim amilase bekerja memotong ikatan α-1.4
glikosidik dan mampu melewati titik percabangan atau ikatan α-1.6-glikosidik
sehingga dapat memutuskan ikatan-ikatan α-1.4 glikosidik di seberangnya untuk
menghasilkan isomaltase. Enzim amilase akan memutuskan ikatan α-1.4 glikosidik
pada rantai amilum sehingga menghasilkan glukosa dalam konfigurasi alfa, maltosa
dan dekstrin (Rahmawati dan Yunianta 2015).
Aktivitas enzim merupakan kemapuan enzim mengubah substrat menjadi
produk. Aktivitas enzim dinyatakan dalam unit per liter (U L-1). Unit aktivitas
enzim menggambarkan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mendegradasi
substrat dalam satu menit. Pengukuran aktivitas suatu enzim dilakukan dengan
menggunakan teknik spektrofotometri (Efiyanti dan Hidayat 2017). Unit aktivitas
enzim alfa amilase merupakan satu mikromol molekul maltosa yang terbentuk per
menit pada suhu dan pH aktivitasnya (Lestari et al 2011).
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH, suhu,
konsentrasi substrat, kofaktor, koenzim, dan inhibitor. Laju aktivitas suatu enzim
akan berada pada kondisi optimum pada lingkungan yang sesuai. Suhu dan pH
mempegaruhi kecepatan sintesis enzim dan inaktivasi enzim. Enzim akan bekerja
optimal pada suhu dan pH optimum. Keadaan pH di atas atau di bawah pH
optimum akan memyebabkan enzim terdenaturasi sehingga sisi aktif enzim tidak
dapat mengikat substrat (Susilowati et al 2012). Kenaikan suhu akan mempercepat
reaksi hingga mencapai suhu optimum enzim. Pemanasan dengan suhu tinggi dapat
menyebabkan enzim terdenaturasi. (Okatviani et al 2012).
Penambahan konsentrasi substrat dapat menyebabkan meningkatkan laju
reaksi enzimatik. Aktivitas substrat akan terus menigkat dengan peningkatan
konsentrasi substrat sampai batas maksimum. Enzim yang mencapai batas
maksimum menyebabkan enzim menjadi jenuh, sehingga penambahan substrat
tidak menyebabkan aktivitas enzim meningkat. Konsntrasi substrat yang rendah
menyebabkan sisi aktif enzim hanya mengikat substrat yang sedikit. Konsentrasi
kompleks enzim-substrat yang sedikit menyebabkan aktivitas enzim semakin
sedikit. Penambahan konsentrasi substrat menyebabkan sisi aktif enzim mengikat
substrat lebih banyak sehingga aktivitas enzim meningkat (Bahri et al 2012).
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh koenzim dan kofaktor dalam mendegradasi
substrat. Koenzim merupakan senyawa organik yang membantu fungsi enzim tetapi
tidak terikat kuat pada molekul dan bersifat tidak permanen (Amalia et al 2013).
Kofaktor merupakan senyawa anorganik yang membantu sisi aktif enzim dalam
mengurai substrat (Pratiwi et al 2013).
Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh inhibitor (penghambat reaksi).
Inhibitor akan menurunkan laju reaksi dengan mengikat sisi aktif enzim sehingga
substrat tidak dapat mengikat substrat. Pengahambatan ada yang bersifat kompetitif
dan non kompetitif. Penghambatan kompetitif terjadi jika inhibitor akan bersaing
dengan substrat untuk mengikat sisi aktif enzim karena adanya kemiripan stuktur
molekul. Pengahambatan non kompetitif terjadi jika inhibitor mengikat sisi enzim
tetapi tidak mempengerahui sisi aktif yang mengikat substrat, tetapi inhibitor
mengubah konformasi enzim sehingga menyebabkan inaktivasi enzim (Sutikno et
al 2016). Praktikum ini bertujuan menentukan pH optimum dan suhu optimum
enzim alfa amilase, mengukur pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas enzim alfa
amilase dan mengetahui kestabilan enzim alfa amilase.

METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum dilakukan pada hari Jumat, 20 Oktober sampai 17 November

2017 pukul 08.00-11.00 WIB bertempat di Laboratorium Pendidikan Biokimia, Lt.
V, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan selama praktikum yaitu peralatan gelas, penangas air,
dan spektrofotometer UV/Vis. Bahan yang digunakan yaitu fraksi amonium sulfat,
buffer fosfat sitrat, buffer fosfat, buffer glisin NaOH, pati, buffer fosfat pH 6, pati,
akuades, reagen kupritartrat, dan reagen fosfomolibdat.

Prosedur Percobaan

Pengaruh pH terhadap Aktivitas Alfa-Amilase

Tabung reaksi sebanyak 18 buah disiapkan, masing-masing 9 tabung
sebagai blanko dan 9 tabung lain untuk sampel. Blanko dibuat dengan
mencampurkan buffer yang sebanyak 0.3 mL, akuades sebanyak 0.1 mL, dan pati
sebanyak 0.1 mL untuk masing-masing blanko buffer fosfat sitrat, fosfat, dan glisin
NaOH. Larutan sampel dibuat dengan mencampurkan buffer sebanyak 0.3 mL, pati
sebanyak 0.1 mL, dan enzim sebanyak 0.1 mL untuk masing-masing sampel buffer
fosfat sitrat (pH 4, 5, dan 6), buffer fosfat (pH 6, 7, dan 8), dan buffer glisin NaOH
(pH 8, 9, dan 10). Tabung reaksi yang berisi blanko dan sampel kemudian
diinkubasi selama 30 menit dalam suhu 37ºC. Kupritartrat sebanyak 1 mL
ditambahkan dan dipanaskan pada suhu 100ºC selama 8 menit di dalam penangas
air. Blanko dan sampel didinginkan pada suhu ruang lalu ditambahkan 7 mL
akuades dan 1 mL fosfomolibdat. Campuran tersebut divortex lalu dibaca nilai
absorban menggunakan spektrofotometer UV/Vis dengan panjang gelombang 660
nm.

Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Alfa-Amilase

Tabung reaksi masing-masing berjumlah 3 disiapkan untuk membuat
blanko dan sampel. Blanko dibuat dengan menambahkan akuades sebanyak 0.1 mL,
pati 0.1 mL, dan buffer fosfat pH 6 sebanyak 0.3 mL. Sampel dibuat dengan
menambahkan enzim sebanyak 0.1 mL, pati 0.1 mL, dan buffer fosfat pH 6
sebanyak 0.3 mL. Sampel dan blanko masing-masing diinkubasi pada suhu ruang
(27ºC), 37ºC, dan 80ºC selama 30 menit. Kupritartrat ditambahkan sebanyak 1 mL
lalu dipanaskan di dalam penangas air dengan suhu 100ºC selama 8 menit. Sampel
dan blanko didinginkan kemudian ditambahkan akuades sebanyak 7 mL dan
fosfomolibdat sebanyak 1 mL. Nilai absorban sampel dan blanko dibaca
menggunakan spektrofotometer UV/Vis dengan panjang gelombang 660 nm.

Uji Kestabilan Enzim Alfa-Amilase

Tabung 1 disiapkan sebagai blanko dengan ditambahkan 1 mL akuades, 3
mL buffer fosfat pH 6, dan 1 mL enzim. Tabung 2 digunakan sebagai sampel
dengan mencampurkan 1 mL pati, 3 mL buffer fosfat pH 6, dan 1 mL enzim.
Tabung 1 dan 2 diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC. Blanko dan sampel
masing-masing diambil 1 mL kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada
suhu 100ºC selama 30 detik. Reagen Folin-Wu ditambahkan setelah dipanaskan.
Sisa larutan diambil 1 mL lagi untuk dijadikan ulangan pada waktu 30 menit hingga
120 menit kemudian dipanaskan pada suhu 100ºC selama 30 detik. Reagen Folin-
Wu ditambahkan kemudian nilai absorban dari blanko dan sampel dibaca pada
panjang gelombang 660 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Larutan buffer merupakan larutan penyangga yang digunakan untuk

mempertahankan pH. Sifat larutan buffer adalah daya tahan terhadap perubahan pH
karena adanya penambahan sidikit asam atau basa. Pembuatan larutan buffer
dilakukan dengan cara mencampurkan larutan asam lemah dengan garam
konjugatnya dan larutan basa dengan garam kinjugatnya (Frantauansyah et al
2013).
Tingkat keasaman juga berpengaruh terhadap struktur enzim sehingga
sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Kondisi pH reaksi enzimatis
memoengaruhi kemampuan enzim mendegradasi substrat. Konformasi enzim
sangat ideal pada pH optimum sehingga interaksi antara enzim dan substrat menjadi
maksimal. Kenaikan atau penurunan pH akan merubah konformasi enzim sehingga
menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Enzim terdiri dari gugus aktif yang
bermuatan negatif dan postif. Aktivitas enzim akan optimum apabila terjadi
kesetimbangan antara kedua muatannya. Keadaan asam akan menyebabkan enzim
mengalami protonasi sehingga kehilangan muatan negatifnya dan keadaan basa
akan menyebabkan enzim terioniasasi sehingga kehilangan mauatan positifnya.
Perubahan pH juga berpengaruh muatan atau struktur residu asam amino yang
berfungsi mengikat substrat. Perubahan pH akan mengakibatkan gusus yang
bermuatan (-NH3+ atau –COO- ) yang berfungsi untuk mempertahankan struktur
tersier akan mengalami perubahan muatan. Perubahan muatan akan menyebabkan
terganggunya ikatan ionik dan terputusnya folding maksimum enzim sehingga
konfrmasi berubah dan aktivitas enzim menurun (Sriwahyuni et al 2015).
Tabel 1 Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase
Absorbansi
Buffer [Glukosa] (mmol)
Terukur Terkoreksi
0,239 - -
Fosfat sitrat pH 4
0,630 0,391 2,72x10-4
0,297 - -
Fosfat sitrat pH 5
0,535 0.238 1,68x10-4
0,279 - -
Fosfat sitrat pH 6
0,578 0,299 2,09x10-4
0,365 - -
Fosfat pH 6
0,590 0,225 1,59x10-4
0,214 - -
Fosfat pH 7
0,899 0,685 4,72x10-4
0,222 - -
Fosfat pH 8
0,388 0,166 1,19x10-4
0,723 - -
Glisin pH 8
0,845 0,122 0,89x10-4
0,675 - -
Glisin pH 9
0,942 0,267 1,87x10-4
0,638 - -
Glisin pH 10
0,868 0,230 1,62x10-4
Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase menggunakan buffer fosfat sitrat,
fosfat dan glisin. Konsentrasi gula yang diperoleh dengan buffer sitrat pH 4 adalah
2,72x10-4 mmol, pH 5 adalah 1,68x10-4 mmol dan pH 6 adalah 2,09x10-4 mmol.
Konsentrasi glukosa dengan buffer fosfar pH 6 adalah 1,59x10-4 mmol, pH 7 adalah
4,72x10-4 mmol dan pH 8 adalah 1,19x10-4 mmol. Konsentrasi glukosa dengan
buffer glisin pH 8 adalah 0,89x10-4 mmol, pH 9 adalah 1,87x10-4 mmol dan pH 10
adalah 1,62x10-4 mmol. Hasil praktikum menunjukkan bahwa pH optimum dari
enzim alfa amilase adalah pH 7. Hal tersebut ditunjukkan dengan tingginya
konsentrasi glukosa atau konsentrasi produk dari penguraian pati oleh enzim
amilase. pH optimum amilase berdasarkan literatur adalah pH 6 (Sriwahyuni et al
2015).
Aktivitas enzim berkaitan erat dengan struktur enzim tersebut. Perubahan
struktur suatu enzim akan menyebabkan perubahan aktivitas enzim. Suhu optimum
akan menyebabkan aktivitas enzim juga menjadi maksimal. Suhu yang rendah akan
menyebabkan enzim tidak memiliki aktivitas yang maksimal, sedangkan kenaikan
akan menyebabkan kenaikan aktivitas enzim. Suhu tinggi yang melewati suhu
optimum enzim akan menyebabkan enzim terdenaturasi. Penurunan aktivitas enzim
pada temperatur tinggi karena sisi aktif enzim telah menjadi rusak. molekul
penyusun enzim akan bergetar atau bergerak sangat cepat yang menyebabakan
ikatan molekul menjadi rusak. Energi panas menyebabkan terputusnya interaksi
non-kovalen tetapi tidak merusak ikatan kovalen seperti ikatan peptida.
Peningkatan suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat karena molekul atom
mempunyai energi yang lebih besar dan kecenderungan untuk berpindah (Bahri et
al 2012).
Peningkatan suhu menyebabkan terjadinya peningkatan gerak temal
molekul, sehingga terjadi kenaikan energi untuk memasuki keadaan transisi Bahri
et al 2012). Praktikum penentuan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim amilase
dilakukan dengan memberi perlakuan suhu berbeda , yaitu 27oC, 37oC dan 80oC.
Konsentrasi glukosa pada suhu 27oC adalah 0,78x10-4 mmol, 37oC adalah 0,36x10-
4
mmol dan 80oC adalah 1,09x10-4 mmol. Konsentrasi glukosa yang tertinggi
terjadi pada suhu 80oC, hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim dalam
mendegradasi pati menjadi glukosa dalam keadaan optimum. Suhu optimum
amilase berdasarkan literatur adalah 40oC (Sriwahyuni et al 2015).
Stabilitas enzim dipengaruhi oleh kekuatan-kekuatan penstabil enzim, yaitu
ikatan hidrogen, interaksi ionik, ikatan logam dan jembatan sulfida. Penstabil enzim
akan menjaga kestabilan enzim, semakin tinggi kekuatan penstabil maka enzim
akan semakin stabil (Noviendri et al 2008). Kestabilan enzim amilase dilakukan
dengan melakukan inkubasi selama 120 menit dengan pengukuran aktivitas setiap
30 menit. Konsentrasi glukosa sebelum dilakukan inkubasi adalah 1,89x10-4 mmol.
Konsentrasi glukosa pada menit ke 30 adalah 3,10x10-4 mmol, menit 60 adalah
4,52x10-4 mmol, menit 90 adalah 3,80x10-4 mmol dan menit 120 adalah 4,50x10-4
mmol. Menit ke-90 menunjukkan aktivitas atau kestabilan enzim menurun. Hal ini
disebabkan enzim sudah terdenaturasi karena semakin lamanya waktu inkubasi
sehingga terjadi penurunan aktivitas enzim dalam mengurai substrat.
Tabel 2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase
Absorbansi
Suhu (˚C) [Glukosa] (mmol)
Terukur Terkoreksi
0,104 - -
27
0,211 0,107 0,78x10-4
0,149 - -
37
0,193 0,044 0,36x10-4
0,112 - -
80
0,264 0,152 1,09x10-4
Tabel 3 Kestabilan enzim
Absorbansi
Waktu (menit) [Glukosa] (mmol)
Terukur Terkoreksi
0,428 - -
0
0,697 0,269 1,89x10-4
0,200 - -
30
0,647 0,447 3,10x10-4
0,209 - -
60
0,865 0,656 4,52x10-4
0,220 - -
90
0,770 0,550 3,80x10-4
0,110 - -
120
0,762 0,652 4,50x10-4

Kestabilan Enzim
0.0005
0.0004
Kadar Glukosa

0.0003
0.0002
0.0001 Kestabilan Enzim

0
0 30 60 90 120
Waktu (menit)

Gambar 1 kurva pengaruh lama inkuasi dengan kestabilan enzim amilase

 SIMPULAN

Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH dan kestabilan enzim. Aktivitas

enzim akan maksimum apabila berada pada suhu dan pH optimum. Kenaikan dan
penurunan suhu dan pH akan mempengaruhi sisi aktif dan konformasi enzim
sehingga dapat menyebabkan perubahan laju aktivitas enzim. Berdasarkan
praktikum pH optimum enzim amilase berada pada pH 7 dan suhu optimum pada
80oC. Kestabilan enzim mengalami penurunan pada menit ke-90 karena terjadinya
denaturasi atau kerusakan enzim.

DAFTAR PUSTAKA

Amalia R, Nurhidayati T, Nurfadilah S. 2013. Pengaruh jenis dan konsentrasi

vitamin terhadap pertumbuhan dan perkembangan biji Dendrobium
lexiflorum J.J smith secara in vivo. J Sains dan Seni Pomits. 1 (1) : 1-6.
Bahri S, Mirzan M, Hasan M. 2012. Karakteristik enzim amilase dari kecambah biji
Epyanti L, Hidayat A. 2017. Seleksi jamur pelapuk putih hutan tropis Indonesia
sebagai penghasil enzim lakase (Lac) dan mangan peroksidase (MnP). J
Penelitian Hasil Hutan. 35 (3) : 185-195.
Frantauansyah, Nuryanti S, Hamzah B. 2013. Ekstrak bunga waru (Hibicus
tiliaceus) sebagai indikator asam basa. J Akad Kim 2. 2 (1) : 11-16.
Lestari P, Richana N, Darwis AA, Syamsu K, Murdiyatmo U. 2011. Purifikasi dan
karakteristik 𝛼-amilase termostabil dari Bacillus stearothermophilus TII-
12. J Agro Biogen. 7 (1) : 56-62.
Noviendri D, Fawzyah YN, Chasanah E. 2008. Karakterisasi dan sifat kinetika
enzim kitinase dari isolat bakteri T5a1 asal terasi. J Pascapanen dan Biotek
Kelautan dan Perikanan. 3 (2) : 123-129.
Oktaviani H, Kariada N, Utami NR. 2012. Pengaruh pengasinan terhadap
kandungan zat gizi telur bebek yang diberi limbah udang. Unnes J Life Sci.
1 (2) : 106-112.
Pratiwi D, Sabayang F, Jalimah I. 2013. Produksi dan karakterisasi enzim lipase
dari Pseudomonas auruginosa dengan menggunakan induser minyak
jagung serta kofaktor Na+ dan Co2+. J Saintia Kim. 1 (2) : 1-5.
Rahmawati A, Yulianta. 2015. Hidrolisis enzimatis pati jahe emprit (zingiber
officinale var. rubrum) dengan enzim αlfa amilase (kajian pengaruh
konsentrasi enzim dan lama inkubasi terhadap sifat fisik dan kimia
dekstrin). J Pangan dan Agroindustri. 3 (3) : 1252-1262.
Sriwahyuni L, Rosahdi TD, Supriadin A. 2015. Isolasi dan karakterisasi amilase
dari biji durian (Durio sp.). J Al Kimiya. 2 (1) : 12-23.
Susilowati EP, Raharjo S, Kurniawati D, Rahim R, Sumarlin, Ardiansyah. 2012.
Produksi xilanase dari isolat sumber air panas sonai, Sulawesi Tenggara,
menggunakan limbah pertanian. J Natur Indo. 14 (3) : 199-204.
Sutikno, Marniza, Selviana, Musita N. 2016. Pengaruh konsentrasi enzim selulase
alfa amilase dan glukoamilase terhadap kadar gula reduksi dari onggok. J
Tek Ind dan Hasik Pert. 21 (1) : 1-12.