LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2018
I. Tujuan
1.1 Mengetahui aktivitas enzim amilase menggunakan metode
kolorimetri dengan pereaksi lugol.
II. Prinsip
2.1 Absorbansi
2.2 Kolorimetri
Kolorimetri merupakan suatu teknik pengukuran yang
didasarkan pada absorbansi cahaya oleh zat berwarna baik warna
yang berasal dari zat itu sendiri maupun warna yang terbentuk
akibat reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990).
(Winarno, 1985)
IV. Teori Dasar
Sekelompok protein yang mengatur dan menjalankan perubahan-
perubahan kimia dalam sistemBiologi. Enzim dihasilkan oleh organ-
organ pada hewan dan tanaman yangsecara katalitik menjalankan
berbagaireaksi, seperti hidrolisis, oksidasi,reduksi, isomerasi, adisi,
transfer radikal, dan pemutusan rantai karbon (Sumardjo,2009).
Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali
lebih cepat dibandingkan ketika reaksi tersebut tidakmenggunakan
katalis. Seperti katalis lainnya, enzim juga menurunkan atau
memeprkecil energi aktivasi suatu reaksi kimia (Poedjiadi dkk, 2009).
Setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu.
Aktivitas enzim akan semakin meningkat denganbertambahnya suhu
hingga suhuoptimum tercapai. Setelah itu, kenaikan suhu lebih lanjut
akan menyebabkanaktivitas enzim menurun (Lehninger, 1982).
Kemampuan enzim yang unik dalam melaksanakan
transformasi kimia yang khas dapat meningkatkan penggunaan enzim
dalam berbagai proses industri. Salahsatu enzim yang sangat
dibutuhkan dalam industri adalahenzim amilase (Suarni dkk, 2007).
Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber mikroorganisme,
tanaman, dan hewan. Molekul amilum atau pati akan dipecah oleh
amilase pada ikatanα-1,4-glikosida dan α-1,6-glikosida. Amilase
dibedakanmenjadi endoamilase dan eksoamilase.Endoamilase
umumnya dikenal sebagai α-amilase, sedangkan eksoamilase dikenal
sebagai β-amilase (sumardjo, 2009).
Pati adalah polimer glukosa dengan rumus molekul
(C6H10O5)n. Pembentukan polimer pati diawali dengan terbentuknya
ikatan glukosida yaitu ikatan antara molekul glukosa melalui oksigen
pada atom karbon pertama. Pati dikelompokkan menjadi dua jenis
yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polimer rantai
lurus yang terdiri dari ribuan glukosa dengan ikatan α 1,4 glukosida.
Jenis kedua yaitu amilopektin yang mengandung percabangan rantai
akibat adanya ikatan α 1,6 glukosida di beberapa bagiannya (Maarel
dkk, 2002).
Proses hidrolisis pati merupakan pemutusan ikatan glikosidik
pada rantai polimernya oleh suatu reaktan yang dibantu oleh air. Proses
ini digunakan di industri untuk memproduksi molekul sederhana
seperti glukosa, maltosa, dan dekstrin. Ikatan glikosidik pada pati
cenderung stabil pada kondisi basa namun kurang stabil pada kondisi
asam. Ikatan tersebut juga dapat putus oleh adanya enzim pemecah
pati. Hasil pemecahantersebut akan menghasilkan gugus aldehid yang
dikenal sebagai gugus ujung reduksi. Banyaknya gugus ujung reduksi
berbanding lurus dengan derajat hidrolisis pati (Kaneko dkk, 2005).
Aktivitas amylase dapat ditentukan dengan metode Caraway-
Somogyi menggunakan iodin atau kalium iodida. Metode ini
menggunakan spektrofotometer untuk mengukur penurunan absorbansi
pati yang terjadi karena aktivitas amilase yang mendegradasi pati pada
ikatan glikosidiknya. Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi pati
sehingga menghasilkan larutan pati yang baku. Larutan ini kemudian
digunakan sebagai substrat dalam mereaksikan dengan sampel yang
mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat pada sampel
akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam
waktu tertentu dan suhu optimum 370C. Reaksi ini kemudian
dhentikan dengan menambahkan larutan HCl 10%. Setelah itu
ditambahkan indikator iodin-kalium iodida dan penurunan absorbansi
pati diukur dengan spektrofotometer UV-vis (Afiukwa, 2009).
Setiap enzim mempunyai sifat dan karakteristik yang spesifik
seperti ditunjukkan pada sifat spesifitas enzim terhadap substrat yang
dinyatakan dengan nilai tetapan Michaelis–Menten (Km). Nilai Km
didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim
mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Untuk
mengetahui hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas
enzim amilase atau kecepatan reaksi, maka dengan
menggunakanmetode Lineweaver-Burk, nilai Vmaks dan Km dapat
dihitung (Bahri dkk, 2012).
5.2 Bahan
a. Amilum
b. Aquadest
c. HCl 10%
d. Larutan lugol
e. Pepaya
VI. Metode
6.1 Pembuatan amilum 0,5%
100 mg amilum dilarutkan dalam 20 ml aquades lalu
dipanaskan hingga larut sempurna. Kemudian larutan didinginkan
dan digenapkan hingga 20 ml kembali (konsentrasi 5000 ppm).
4. Dilakukan sentrifugasi
5. Diambil substrat dari hasil
sentrifugasi
Perhitungan pereaksi
Panjang Absorbansi
gelombang Absorbansi sampel rata- absorbansi
sampel rata blanko konsentrasi rata-rata
2,288
630 nm 2,117 2,2025 0,13 437,85
2,221
635 nm
2,016 2,1185 0,128 460,6 447,56
2,176
640 nm
1,930 2,053 0,123 444,23
a. 630 nm
2,0275 = 0,004x + 0,2761
x = 437,85
b. 635 nm
2,1185 = 0,004x + 0,2761
x = 460,6
c. 630 nm
2,053 = 0,004x + 0,2761
x = 444,23
X
a. Pada lamda 630 nm
15,55 x 10.262,725
= 159.543 unit/ ml
c. Pada lamda 640 nm
16,10 x 10.262,725
= 165.186 unit/ ml
178.099 unit/ ml x
= 406,66 unit/mg
159.543 unit/ ml x
= 346,38 unit/mg
165.186 unit/ ml x
= 371,84 unit/mg
VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan Uji aktivitas Amilase dengan
metode Kolorimetri menggunakan pereaksi lugol. Tujuan nya adalah
menganalisis aktivitas amilase dengan metode kolorimetri
menggunakan pereaksi lugol.
Sampel yang digunakan adalah pepaya. Setiap 100 gram
pepaya rata-rata mengandung : 86,6 gram air 0,5 gram protein 0,3
gram lemak 12,1 gram karbohidrat. Kandungan gula utamanya adalah
sukrosa (48,3 persen), glukosa (29,8 persen), dan fruktosa (21,9
persen) (Lakitan, 2007). Pepaya sangat ampuh dalam penggunaannya
sebagai penjaga sistem pencernaan.
Enzim amilase merupakan enzim yang mampu bertindak
sebagai katalis dalam reaksi hidrolisis pati oleh air membentuk gula.
Gula merupakan produk konstituen utama dalam industri makanan dan
minuman. Enzim amilase merupakan salah satu jenis enzim
pencernaan yang dihasilkan oleh kelenjar ludah dan mulut. Amilase
dapat di peroleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan
mikroorganisme.
Metode yang digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim
amilase ini adalah kolorimetri dan dilakukan dengan bantuan
instrumen microplate reader. Dengan instrumen ini maka akan dihitung
absorbansi pada sampel. Microplate reader digunakan untuk mengukur
absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang
gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa. Sebagian dari
cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai
absorbansi dari cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi
larutan di dalam microplate reader.
Preparasi sampel dilakukan dengan cara mengerus 25 g sampel
pepaya tersebut lalu menambah air disaring dan disentrifugasi selama
15 menit dengan kecepatan 3000 rpm agar terjadi pemisahan menjadi
dua fase dimana fase atas memiliki massa jenis yang lebih kecil
daripada bagian yang mengendap lalu diambil bagian atasnya untuk
dilakukan pengujian amilase.
Pereaksi dalam uji enzim amilase ini disediakan. Pereaksi yang
diperlukan yakni Amilum, HCL, dan lugol. Pembuatan kurva baku
dibuat terlebih dahulu. Kurva baku merupakan standar dari sampel
tertentu yang dipakai sebagai acuan parameter kadar sampel tersebut
dalam percobaan.
Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui
hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansi sehingga
nilai konsentrasi dari sampel dapat diketahui. Rentang konsentrasi
dibuat untuk mendapatkan suatu persamaan regresi linier secara
matematika sehingga dapat digunakan untuk menentukan kadar suatu
sampel dengan memasukan nilai kedalam persamaan tersebut. Regresi
linier yang baik adalah nilai R yang mendekati 1.
Prosedur dalam pembuatan kurva baku adalah dengan
mencampurkan amilum dengan aquades. Amilum ditimbang sebanyak
0,08 gram, dan kemudian dilarutkan dengan aquades sebanyak 10 ml
dalam labu ukur 10 ml. Sehingga didapatkan amilum 8000 ppm dalam
labu ukur 10 ml.
Penggunaan labu ukur dalam hal ini dikarenakan kita akan
membuat larutan baku dimana konsentrasi dari larutan tersebut harus
pasti dan tidak berbubah-ubah karena faktor lingkungan, sehingga
digunakan labu ukur yang lebih kuantitatif dari pada membuat larutan
baku di dalam gelas beaker. Setelah itu, larutan stok 8000 ppm
diencerkan menjadi 4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250
ppm, 125 ppm, 62,5 ppm sebanyak masing-masing konsentrasi 5 ml.
Pengenceran dilakukan didalam labu ukur dengan
menggunakan pipet volume. Hal ini dikarenakan konsentrasi dari
larutan baku yang tidak boleh terganggu sehingga digunakannya alat-
alat yang lebih kuantitatif, seperti pipet volume dari pada gelas ukur.
Variasi konsentrasi yang dibuat disini ditujukan untuk mendapatkan
titik-titik pada sumbu absis ketika pembuatan grafik kurva baku nanti.
Grafik kurva baku memiliki syarat minimal 5 titik untuk mendapatkan
nilai regresi linier yang baik. Untuk menghindari kesalahan sehingga
menyebabkan regresi yang didapatkan tidak bagus, maka dibuat 7 titik
dari variasi konsentrasi diatas, sehingga dapat meminimalisir hasil
regresi yang kurang bagus.
Sampel dimasukkan ke dalam microplate reader sebanyak 40
mikroliter dengan menggunakan mikropipet. Lalu diinkubasi selama 7
menit. Fungsi inkubasi disini supaya enzim pada sampel dapat bekerja
menghidrolisis amilum. Tetapi tetap diperhatikan kondisi suhu.
Mengingat bahwa sifat enzim adalah termolabil atau bergantung pada
suhu. Suhu yang dipakai adalah 37°C pada suhu tersebut enzim bekerja
secara optimum. Penggunaan suhu yang terlalu tinggi dapat
menimbulkan denaturasi enzim dan bagian aktif enzim akan terganggu,
sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang.
Pada percobaan ini sampel yang mengandung enzim amilase
dicampur dengan amilum. Sampel yang digunakan adalah pepaya.
Enzim akan bekerja menghidrolisis amilum menjadi molekul yang
lebih sederhana menjadi dimer atau monomer pentosa. Dari hal
tersebut selanjutnya diuji kembali kadar amilum dalam sampel dengan
menggunakan microplate reader. Jika kadar amilum dalam sampel
berkurang maka dapat disimpulkan bahwa terdapat aktivitas enzim
amilase dalam sampel. Hal itu bisa didapatkan setelah nilai absorbansi
sudah ditemukan.
Setelah inkubasi selesai selama 7 menit maka kerja enzim
tersebut dihentikan dengan penambahan HCl. Kenapa digunakan HCl,
hal ini dikarenakan enzim hanya bekerja optimum pada pH netral
sedikit basa, sehingga penambahan HCl akan menyebabkan rusaknya
enzim dan proses pemecahan pati yang dikatalisis oleh enzim ini akan
melambat atau berhenti, dikarenkan enzim telah rusak.
Langkah selanjutnya adalah penambahan lugol pada larutan
sampel tersebut. Lugol merupakan pereaksi spesifik terhadap amilum.
Reagen pada Lugol terdiri dari KI dan I2 . Ketika ditambahkan pada
amilum ion I- akan berikatan dengan amilum dan menghasilkan warna
biru. Apabila saat lugol ditambahkan pada sampel timbul warna biru
berarti sudah terjadi aktivitas amilase, apabila tidak terjadi perubahan
warna saat dicampurkan maka zat tersebut belum terhidrolisis dan
sampel belum memiliki aktivitas amilase. Kemudian microplate
dimasukkan kedalam microplate reader dan dibaca nilai absorbansinya
dengan panjang gelombang 630 nm, 635 nm dan 640 nm ,karena
warna sampel ini sesuai dan dapat dibaca dengan panjang gelombang
tersebut.
Maka akan didapatkan hasil absorbansi, kita dapat mengetahui
baik atau buruknya aktivitas enzim amilase yang terkandung dalam
sampel yang diamati. Semakin kecil nilai absorbansinya maka aktivitas
enzim amilase dalam sampel semakin baik. Begitu pula sebaliknya,
semakin besar nilai absorbansinya maka aktivitas enzim amilase dalam
sampel buruk.
Ini dikarenakan, ketika penambahan amilase pada sampel,
enzim yang berasal dari sampel akan mengatalisis proses
penghidrolisisan pati membentuk glukosa. Pada saat proses reader,
absorbansi yang didapatkan menggambarkan jumlah banyaknya
amilase sisa yang tidak terhidrolisis menjadi glukosa.
Amilase disini menyerap panjang gelombang dengan
absorbansi tertentu, karena sebelum pembacaan, pada microplate,
sampel ditambahkan pereaksi lugol, dimana pereaksi tersebut spesifik
akan bereaksi dengan amilum membentuk warna biru tua. Sehingga
terjadi pewarnaan pada sampel.
Salah satu syarat sampel untuk dilakukan pembacaan
absorbansi pada microplate reader adalah sampel harus memiliki
warna, tetapi tidak terlalu pekat. Karena ditakutkan akan mengganggu
proses penyerapan panjang gelombang dari sampel, sehingga
gelombang akan dipantulkan.
Setelah pewarnaan, sampel juga harus memiliki konsentrasi
yang tidak terlalu pekat, maka sebelumnya pada saat preparasi sampel,
sampel di encerkan untuk menghindari kepekatan konsentrasi dari
sempel tersebut.
Hasil akhir didapatkan aktivitas enzim amilase pada pepaya
pada beberapa panjang gelombang saat mengamati dengan absorbansi.
Pada lamda 630 nm didapatkan 178,099 unit/ml , pada lamda 635 nm
didapatkan 159,543 unit/ml dan pada lamda 640 nm didapatkan
165,186 unit/ml.
Aktivitas enzim diukur sebagai jumlah amilum yang terkatalis
oleh sejumlah enzim dalam waktu tertentu. Aktivitas spesifik enzim
unit/mg didapatkan sebesar yaitu pada lamda 630 nm (C = 437,85)
406,66 unit/mg, lamda 635 nm (C = 460,6) 346,38 unit/mg dan lamda
640 nm (C= 444,23) 371,84 unit/mg
IX. Kesimpulan
9.1 Didapatkan aktivitas enzim amilase pada buah pepaya yaitu
Pada lamda 630 nm didapatkan 178,099 unit/ml , pada lamda 635
nm didapatkan 159,543 unit/ml dan pada lamda 640 nm didapatkan
165,186 unit/ml.
9.2 Didapatkan aktivitas spesifik enzim amilase pada buah
pepaya pada lamda 630 nm (C = 437,85) 406,66 unit/mg, lamda
635 nm (C = 460,6) 346,38 unit/mg dan lamda 640 nm (C=
444,23) 371,84 unit/mg.
DAFTAR PUSTAKA
Afiukwa, et. al. 2009. Determination of amylase activity of crude extract from
partially germinated mango seeds (Mangifera oraphila). Tersedia
online di http://www.academicjournals.org/AJB [diakses pada 16 Mei
2016].
Bahri, Syaiful,Moh. Mirzan, dan Moh. Hasan. 2012. Karakterisasi Enzim
Amilase Dari Kecambah Biji Jagung Ketan (Zea mays ceratina L.).
Jurnal Natural ScienceVol. 1.(1) 132-143.
Kaneko, T. Ohno, T. and Ohisa, A. 2005. Purification and Characterization
of a Themostable Raw Starch Digesting Amylase from a Streptomyces
Milling Factory. Biosci. Biotechnol. Biochem Vol. 69. (6) 1073-1081.
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Lakitan, B. 2007. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta : Rajawali Pers.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-DasarBiokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Maarel, M.J.E.C., Veen, B. Uitdehaag, J.C.M., Leemhuis, H., and Dijkhuizen,
L. 2002. Properties and Applications of Starch-converting Enzymes of
the α- amylase Family.Journal of Biotechnology Vol. 94 137-155.
Martin.1983. Farmasi Fisik. Jakarta : UI Press.
Poedjiadi, A., Supriyanti, F.M.T. 2009.Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta:
Penerbit Universitas Indonesia.
Suarni dan Patong, R. 2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai
Sumber Enzim α-Amilase. Indo. J. Chem. Vol. 7 (3) 332-336.
Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia Cetakan I. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
Winarto, F.G. 1985. Enzim Pangan. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama