LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOKIMIA

Uji Aktivitas Amilase (Metode Kolorimetri dengan Pereaksi Lugol)

KELOMPOK 3
SHIFT C

Disusun oleh:

1. Elsa Daw Cristin 260110170093

2. Rhayza Salsabila 260110170094
3. Ahmad Fahim F. 260110170095
4. M. Sulthan Ryan 260110170096
5. Patria Pari A.A.S. 260110170097

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2018
I. Tujuan
Menganalisis aktivitas enzim amilase menggunakan metode kolorimetri dengan
pereaksi lugol.
II. Prinsip
2.1 Aktivitas Enzim
Terkadang enzim memerlukan kofaktor senyawa organik atau logam untuk
melakukan aktivitasnya dalam proses reaksi biokimia (Poedjiadi, 1994).
2.2 Metode Kolorimetri
Metode pengukuran didasari absorbansi cahaya oleh zat berwarna (Khopkar,
1990).

III. Reaksi

3.1. Reaksi Amilum dengan enzim Amilase

(Winarno, 1985).

IV. Teori Dasar

Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk

berbagai reaksi kimia dalam sistem biologik. Hampir tiap reaksi kimia dalam sistem
biologis dikatalisis oleh enzim. Sintesis enzim terjadi didalam sel dan sebagian besar enzim
dapat diekstraksi dari sel tanpa merusak fungsinya
(Lehninger, 1995).

Meskipun senyawa katalis dapat berubah pada reaksi awal, pada reaksi akhir
molekul katalis akan kembali ke bentuk semula. Sebagian besar enzim bekerja secara khas,
yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi
kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai
contoh, enzim α-amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi
glukosa. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu,
keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat keasaman)
optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami
perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai,
enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal
ini akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga
dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan aktivitas enzim,
sedangkan aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim. Banyak obat dan racun
adalah inihibitor enzim (Chen, 1992).

Sama seperti protein-protein lainnya, enzim merupakan rantai asam amino yang
melipat. Tiap-tiap urutan asam amino menghasilkan struktur pelipatan dan sifat-sifat
kimiawi yang khas. Rantai protein tunggal kadang-kadang dapat berkumpul bersama dan
membentuk kompleks protein. Kebanyakan enzim dapat mengalami denaturasi (yakni
terbuka dari lipatannya dan menjadi tidak aktif) oleh pemanasan ataupun denaturan
kimiawi. Tergantung pada jenis-jenis enzim, denaturasi dapat bersifat reversibel maupun
ireversibel (Boyer, 2002).

Proses pengolahan pati menjadi gula dapat dilakukan menggunakan dua jenis
katalis, yaitu katalis asam dan katalis enzim. Pengolahan pati dengan katalis enzim terdiri
dari dua tahap, yaitu likuifaksi dan sakarifikasi. Pada tahap likuifaksi, enzim yang
digunakan adalah enzim α-amilase yang membantu proses hidrolisis pati (polisakarida)
menjadi oligosakarida, berupa limit dekstrin dan senyawa oligosakarida lainnya. Proses
pengolahan dilanjutkan dengan penambahan enzim lainnya selama proses sakarifikasi.
Jenis enzim yang ditambahkan selama proses sakarifikasi spesifik tergantung jenis dan
karakteristik produk gula yang ingin dihasilkan (Savageau, 1995).

Pengujian aktivitas enzim biasanya dilakukan untuk menentukan aktivitas enzim

α-amilase yang telah disimpan terlalu lama. Selain itu, juga dapat menentukan aktivitas
enzim α-amilase hasil recovery. Biasanya recovery enzim dilakukan menggunakan
membran dengan teknologi reverse osmosis dan elektrodeionisasi. Elektrodeionisasi juga
luas digunakan untuk penghilangan asam. Penentuan aktivitas enzim α-amilase hasil
recovery penting untuk diketahui karena proses recovery menggunakan membran
terkadang diiringi dengan adanya fenomena fouling. Fenomena fouling dapat dicegah
melalui backflushing untuk membran mikrofiltrasi dan penggunaan cleaning agent.
Selain recovery enzim, membran juga dapat digunakan untuk menghilangkan turbiditas
produk minuman seperti jus apel (Encyclopedia Britannica,2016).
Amilase adalah enzim yang mengkatalisis pemecahan pati me njadi gula. Enzim
amilase terbagi menjadi α-Amilase, β-Amilase, γAmilase. Enzim Amilase merupakan
komponen yang sangat penting pada proses pencernaan makanan. Enzim ini mengubah
karbohidrat menjadi gula yang pada akhirnya diubah menjadi ATP. Enzim amilase yang
terkandung dalam saliva dapat menghidrolisis ikatan 1,4glikosidik yang terdapat dalam
amilum menghasilkan dextrin, maltosa, dan sejumlah kecil glukosa dengan konfigurasi
gula (Endah, 2011).
Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi disakarida yang lebih
sederhana, bahkan mengkonversi mereka menjadi monosakarida seperti glukosa. Amilase
tidak hanya mencerna karbohidrat, tetapi juga mencerna sel darah putih yang mati (pus).
Amilase juga terlibat dalam reaksi antiinflamasi seperti yang disebabkan oleh pelepasan
histamine dan zat-zat lain yang serupa. Respon inflamasi biasanya terjadi pada organ yang
berhubungan dengan lingkungan luar (Kimball, 1991).
Aktivitas enzim α-amilase dilakukan dengan menggunakan larutan iodin
melalui metode Fuwa. Larutan iodin pada dasarnya berwarna kuning kecoklatan. Akan
tetapi, larutan iodin dapat membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan pati.
Oleh sebab itu, absorbansi warna biru yang terukur oleh spektrofotometer di akhir reaksi
menunjukkan jumlah pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim. Dengan demikian,
kemampuan enzim dalam hidrolisis pati dapat diketahui dari jumlah pati tersisa dalam
larutan (Sadikin, 2001).
 V. Alat dan Bahan
5.1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu alat sentrifugasi, batang
pengaduk, beaker glass 250 ml, gelas ukur 50 ml, labu ukur 50 ml, labu ukur 100 ml, mortir
dan stamper, penangas air, pipet tetes, spektrofotometer, dan tabung sentrifugasi.

5.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu amilum 0,5%, aquades,
buffer asetat, HCl, jagung, dan KI.

VI. Data Pengamatan

No. Perlakuan Hasil
1. Preparasi sampel :
- Menimbang sampel 25 gr Didapatkan larutan sampel yang
- Menghaluskan sampel dan homogen
tambahkan 25 ml aquadest
- Mensentrifugasi dalam 3000 Didapatkan ekstrak sampel
rpm selama 10 menit

2. Pengenceran HCl :
- Dilarutkan 81 ml HCl pekat Didapatkan larutan HCl 30%
dalam 100 ml aquadest
3. Pembuatan amilum 0,5% :
- Amilum 0,1 gram dilarutkan Warna larutan dari putih menjadi
dalam aquadest 20 ml lalu bening
dipanaskan sampai larut
4. Pembuatan reagen Lugol :
- Ditimbang 300 mg KI dan Didapatkan larutan KI kuning
dilarutkan dalam 10 ml kecoklatan
aquadest
- Ditimbang 30 mg I2 dan Larutan kuning kecoklatan
dimasukkan ke larutan KI
5. Pembuatan larutan kontrol :
- Dipipet 75 µl amilum dan
dimasukkan ke microplate
- Ditambahkan 10 µl HCl dan 20
µl lugol
- Dibaca absorbansinya pada Didapat warna absorbansi orange
panjang gelombang 627 nm kemerahan dan absorbansi sebesar
0,066 ; 0,067 ; dan 0,068
6. Uji aktivitas Amilase
- Sampel sebanyak 40 µl Didapat 75 µl amilum dalam
dimasukkan ke dalam microplate kolom 1 baris A,B,C
microplate lalu ditambahkan 75
µl amilum
- Sampel diinkubasi selama 7 Sampel terinkubasi
menit
- Ditambahkan 10 µl HCl dan 20
µl lugol
- Sampel dibaca absorbansinya Didapat warna absorbansi orange
pada panjang gelombang 627 kemerahan dan absorbansi tidak
nm terbaca (overflow)

VII. Perhitungan
7.1 Amilum 0,5%; 100 mL

Amilum 0,5% = 0,5 gram / 100 ml

= 500 mg / 100 ml

7.2 Pengenceran HCl 30%; 100 mL

N1. V1 = N2. V2
37%. V1 = 30%. 100 mL
V1 = 81, 1 mL, ditambahkan aquadest hingga 100 mL pada labu ukur
7.3 Larutan lugol 0,015%

300𝑚𝑔 𝐾𝐼 300𝑚𝑔 𝐼2
Iodium = +
10𝑚𝐿 20𝑚𝐿
𝑥
0,015% = 20 x 100
0,015
x= = 0,03 gr = 30 mg
5

VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan uji aktivitas amilase dengan metode kolorimetri
menggunakan pereaksi lugol. Aktivitas enzim ditentukkan berdasarkan jumlah gula
pereduksi yang dilepaskan dan diukur secara kolorimetri. Sampel yang kelompok kami
gunakan adalah wortel.

Pada praktikum ini, uji aktivitas amilase dilakukan melalui pengujian sampel.
Larutan amilum digunakan sebagai larutan baku atau larutan kontrol atau larutan standar.
Pembuatan larutan baku ini bertujuan agar rentang absorbansi sampel berada diantara
range absorbansi larutan baku tersebut. Selain itu, larutan baku juga digunakan sebagai
pembanding yaitu dengan cara larutan baku (larutan yang sudah diketahui konsentrasinya)
dihitung absorbansinya menggunakan microplate reader. Selain dibuat larutan standar,
dibuat juga blanko yang berupa aquadest. Pembuatan blanko ini bertujuan untuk
mengetahui nilai absorbansi dari aquadest, dengan begitu dapat diketahui nilai absorbansi
asli dari sampel dan larutan standar (amilum).

Pengujian berdasarkan absorbansi didasarkan oleh Hukum Lambert Beer yang

menyatakan bahwa besarnya absorbansi cahaya berbanding lurus dengan konsentrasi dan
ketebalan medium. Hal ini berarti semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi pula
absorbansinya. Dengan begitu, data absorbansi dapat digunakan untuk mencari konsentrasi
suatu larutan sampel.

Untuk mengetahui apakah suatu unsur memenuhi Hukum Lambert Beer atau tidak
maka perlu dibuat grafik kalibrasi (kurva baku) absorbansi dan konsentrasi. Hukum
Lambert Beer terpenuhi jika dalam percobaan yang dilakukan range konsentrasi hasil
kalibrasi (kurva baku) menghasilkan plot berupa garis lurus (linear range). Plot atau grafik
ini didapat dari data, yaitu hubungan antara absorbansi larutan standar (amilum) dengan
berbagai variasi konsentrasi larutan standar (amilum).

Untuk pengujian sampel, digunakan alat mikropipet dan microplate reader.

Mikropipet adalah suatu alat yang digunakan untuk memindahkan sampel dalam jumlah
kecil secara akurat. Selain akurasi, pipet jenis ini juga memiliki presisi yang sangat bagus
dibanding dengan pipet gelas atau pipet ukur lainnya. Pemipetan zat dilakukan dengan
posisi mikropipet harus tegak, tidak boleh miring. Jika posisi pipet saat memindahkan zat
miring, dikhawatirkan masih ada sisa zat yang tertinggal di dalam mikropipet.

Penambahan larutan HCl 30% ialah untuk menghentikan reaksi hidrolisis yang
terjadi. HCl menghentikan reaksi melalui proses denaturasi protein. Protein memiliki sifat
zwitter ion dan titik isoelektrik dimana jumlah muatan positif dan muatan negatif pada
protein adalah sama. Mekanisme kerja yang terjadi yaitu penambahan asam dan basa dapat
mengacaukan jembatan garam yang terdapat pada protein. Ion positif dan negatif pada
garam dapat berganti pasangan dengan ion positif dan negatif dari asam ataupun basa
sehingga jembatan garam pada protein yang merupakan salah satu jenis interaksi pada
protein, menjadi kacau dan protein dapat dikatakan terdenaturasi. Penambahan HCl pada
larutan substrat ini sebagai pemberi elektrolit Cl- agar aktivitas dari ptialin meningkat.
Selain itu, penambahan HCl pada prosedur ini berfungsi untuk menciptakan suasan asam
pada reaksi karena pada larutan tersebut akan ditambahkan larutan KI (iodium) 0,015%
yang berfungsi sebagai indikator warna.

Penambahan pereaksi lugol atau iodium atau KI ini berfungsi sebagai indikator,
dimana sisa pati yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator KI yang berwarna
coklat. KI pada suasana asam akan melepaskan iod dan akan memberikan warna pada
larutan. Setelah ditambahkan KI, warna sampel berubah menjadi biru.

Absorbansi larutan standar amilum dibuat dengan berbagai variasi konsentrasi. Hal
ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kenaikan konsentrasi dengan absorbansi yang
diperoleh. Menurut literatur, seharusnya semakin tinggi konsentrasi zat maka nilai
absorbansinya juga akan semakin meningkat. Hasil absorbansi yang bagus seharusnya
bernilai diatas 0,2. Namun, seharusnya semakin besar konsentrasi maka absorbansinya
juga semakin besar. Kesalahan ini bisa dipengaruhi karena saat pengambilan zat, zat yang
terambil terlalu banyak atau terlalu kurang sehingga ketika pengenceran menjadi lebih
encer. Selain itu, adanya pengotor dari hasil sentrifugasi sampel memungkinkan terjadi
kesalahan. Lalu, alat laboratorium yang kurang steril juga bisa menjadi faktor lainnya.

IX. Kesimpulan
Didapat data aktivitas enzim amilase dengan metode kolorimetri dengan absorbansi
warna jingga kemerahan dan nilai absorbansi tak terbaca (overflow). Nilai absorbansi
dengan aktivitas enzim amilase berbanding terbaik sehingga semakin tinggi nilai
absorbansi, aktivitas enzim amilase akan semakin menurun.
 DAFTAR PUSTAKA

Boyer, Rodney. 2002. Concepts in Biochemistry. New York: John Wiley & Sons, Inc
Chen L. H. 1992. 4-Oxalocrotonate tautomerase, an enzyme composed of 62 amino acid
residues per monomer. J. Biol. Chem. 267 (25): 17716–21. PMID 1339435.
Endah, R. 2011. Aktivitas immobilizer β-amilase dan free β-amilase dari
Zoogloearamigera ABL 1 dalam medium pati cair dengan perlakuan faktor
lingkungan. J. Biota. 16(1) : 95-98.
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Kimball, John W 1991. Biologi Edisi Kelima Jilid Tiga. Jakarta: Erlangga.
Lehninger, A. L. 1995. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga
Martin.1983. Farmasi Fisik. Jakarta : UI Press.
Poedjiadi, A dan Supriyatin, T. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Universitas
Indonesia.
Sadikin, Mohammad. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta: Widya Medika.
Savageau, M. A. 1995. Michaelis-Menten mechanism reconsidered: implications of fractal
kinetics. J. Theor. Biol. 176 (1): 115–24
Encyclopedia Britannica. 2016. Enzyme. Available at
https://www.britannica.com/science/enzyme [Accessed on 19th May 2018].
Winarto, F.G. 1985. Enzim Pangan. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama.