LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

UJI AKTIVITAS AMILASE

(METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI LUGOL)

Hari/Jam praktikum : Senin/ Pukul 10.00-13.00 WIB

Tanggal praktikum : 14 Mei 2018
Kelompok :1
Asisten : 1. Anasya Ridha
2. Rahma Alya Nafisah

Disusun oleh :
Shahnaz Aulia F 260110170083 Pembahasan
Nada Salsabila R 260110170084 Perhitungan, Pembahasan
Nur Selvia Y 260110170085 Editor, Prinsip, Kesimpulan
Kamila Shiba 260110170086 Teori Dasar, Reaksi
Ivana Santoso 260110170087 Data Pengamatan, Metode

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2018
I. Tujuan
Menganalisis aktivitas amilase dengan metode kolorimetri menggunakan
pereaksi lugol.

II. Prinsip
2.1 Aktivitas Enzim Amilase
Mekanisme kerja enzim amilase ini adalah dengan menghidrolisis
ikatan α-1,4 glukosidik pada rantai polisakarida (Wijayanti, 2017).

2.2 Kolorimetri
Kolorimetri merupakan salah satu analisis yang didasarkan pada
absorbsi cahaya pada panjang gelombang cahaya tampak (visible)
(Lestari, 2007).

2.3 Hukum Lambert Beer

Hukum ini menunjukkan hubungan antara absorbansi cahaya dengan
konsentrasi suatu sampel yang mengabsorbsi cahaya tersebut.
Persamaannya dapat ditulis :

(Lestari, 2007).

III. Reaksi
IV. Teori Dasar

Pengaplikasian amilase yang digunakan di dunia industri sangat luas, hal

ini menyebabkan kebutuhan terhadap amilase menjadi tinggi terutama amilase
yang mempunyai sifat termofil. Peningkatan ini disebabkan karena enzim ini
banyak digunakan dalam industri, seperti industri tekstil, pangan, dan deterjen
(Fitriani, 2013).
Enzim yang digunakan untuk pengelolaan pati di industrinya adalah
enzim amilase, fungsi enzim ini adalah untuk menhidrolisis polisakarida
menjadi gula yang lebih sederhana (Akpan dan Adelaja, 2003).
Berdasarkan kemampuannya dalam menghidrolisis pati dan berbagai
keuntungan dari aplikasi yang dapat diberikannya maka enzim amilase tersebut
harus diketahui aktivitasnya. Faktor-faktor yang memengaruhi aktivitas enzim
adalah suhu dan pH. Tingkat sensitifitas enzim terhadap perubahan sangat
kuat, hal ini akan mempengaruhi aktifitas dan stabilitas enzim (Illaneus, 2008).
Enzim amilase memiliki aplikasi untuk skala yang sangat luas mulai dari
industri tekstil, konversi pati untuk gula sirup, produksi Cyclodextrins untuk
industri farmasi (Aiyer, 2005). Penggunaan enzim amilase selain dalam
saccaharification pati telah ditemukan, seperti potensinya dalam
pengaplikasian dlam proses industri makanan, industri kue, pembuatan bir,
tekstil deterjen, dan industri kertas (Pandey et al., 2000).
Enzim yang dihasilkan oleh makhluk hidup akan membantunya dalam
mengkatalisis reaksi-reaksi biokimi yang terdapat di dalam tubuhnya sehingga
reaksi-reaksi tersebut berlangsung lebih cepat (Sianturi, 2008). Menurut
Sutiamiharja (2008) kemampuan enzim yang unik dalam melaksanakan
transformasi kimia yang khas dapat meningkatkan penggunaan enzim dalam
berbagai proses industri. Salah satu enzim yang sangat dibutuhkan dalam
industri adalah amilase (α-amilase, β- amilase, dan γ-amilase atau
glukoamilase).
Dalam dunia industri kebutuhan enzim amilase sangat tinggi,
penjualannya sudah mencapai US $2 milyar , di sisi lain kebutuhan amilase di
industri makanan dan minuman sudah mencapai US $11 juta
(Sivaramakrishnan dkk., 2006).
Enzim amilase yang dihasilkan pada proses dialisis akan dikarakterisasi
pada kondisi menurut suhu, pH optimum, dan konsentrasi substrat optimum
enzim amilase. Cara yang digunakan untuk menguji aktivitas enzim amilase
yaitu dengan mencampurkan enzim, substrat, dan buffer lalu diinkubasi pada
beberapa variasi perlakuan (Mufti, 2013).
Enzim merupakan sekelompok protein yang mengatur dan menjalankan
perubahan-perubahan kimia dalam sistem Biologi. Hewan dan tanaman yang
menghasilkan enzim secara katalitiknya akan menjalankan berbagai reaksi,
seperti hidrolisis, oksidasi, reduksi, isomerasi, adisi, transfer radikal,
pemutusan rantai karbon (Sumardjo, 2009). Enzim adalah biokatalisator yang
berfungsi sebagai katalis dalam proses biologis (Lehninger, 1982). Secara
umum, enzim menghasilkan kecepatan, spesifikasi, dan kedali pengaturan
terhadap reaksi dalam tubuh. Enzim berfungsi sebagai katalisator, yaitu
senyawa yang meningkatkan kecepatan reaksi kimia (Marks, dkk., 2000).
 Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat
dibandingkan ketika reaksi tersebut tidak menggunakan katalis. Seperti katalis
lainnya, enzim juga menurunkan atau memeprkecil energi aktivasi suatu reaksi
kimia (Poedjiadi dan Supriyanti, 2009). Dalam raksi tersebut enzim mengubah
senyawa yang selanjutnya disebut substrat menjadi suatu senyawa yang baru
yaitu produk, namun enzim tidak ikut berubah dalam reaksi tersebut (Palmer,
1991).
Masing-masing enzim memiliki aktivitas maksimumnya tersendiri pada
suhu tertentu, aktivitasnya akan meningkat dengan bertambahnya suhu hingga
suhu optimum tercapai. Setelah suhu optimum terlampaui akan menyebabkan
aktivitas enzim menurun (Megiadari, 2009). Pada suhu 40 ℃ enzim amilase
mencapai suhu optimum untuk menghidrolisis substrat dengan nilai aktivitas
mencapai 0,42 U/mL (Ateng, 2015)

V. Alat dan Bahan

5.1. Alat

a. Alat sentrifugasi
b. Corong
c. Gelas kimia
d. Kertas saring
e. Labu ukur
f. Mikropipet
g. Microplate reader
h. Mortir dan Stamper
i. Pipet tetes
j. Rak tabung reaksi
k. Tabung reaksi
l. Tabung sentrifugasi
 m. Timbangan analitik

5.2 Bahan

a. Amilum 0,5% b/v

b. Asam Klorida 30% v/v
c. Aquadest
d. Iodium 0,015% b/v
e. Kalium Iodida
f. Sampel (Buah Apel)

VI. Metode

6.1 Preparasi sampel

Ditimbang 25 gr sampel buah apel dan digerus hingga halus.

Ditambahkan aquadest hingga volume 50 ml. Dimasukkan ke dalam tabung
sentrifugasi dan di lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama
10 menit.

6.2 Pembuatan amilum 0,5 %

Ditimbang amilum 100 mg dan dilarutkan dalam 20 ml aquadest

kemudian dipanaskan hingga larut semuanya (bening tak berwarna).
Larutan didinginkan dan digenapkan 20 ml dengan aquades (5000 rpm).

6.3 Pembuatan pereaksi lugol 0,015%

Ditimbang 300 mg KI dan dilarutkan dalam 10 ml aquadest.

Ditimbang 30 mg I2 dan dimasukkan ke dalam larutan KI. Ditambahkan
aquadest hingga volume larutan mencapai 20 mL.
 6.4 Pembuatan HCl 30% 100 mL

Diambil larutan HCl pekat sebanyak 30 mL, lalu dimasukkan ke

dalam labu ukur 100 mL yang telah terisi 50 mL aquadest. Aquadest
ditambahkan hingga volume mencapai 100 mL.

6.5 Pembuatan Kurva Baku

Amilum 500 ppm diambil sebanyak 0,1 mL ; 0,2 ml ; 0,3 mL ; 0,4

mL ; dan 0,5 mL, lalu masing-masing amilum ditambahkan 0,5 mL HCl, 4
mL aquadest, dan 0,5 mL lugol. Diukur absorbansi pada panjang
gelombang 627 nm.

6.6 Pengujian Sampel

Ke dalam microplate, dimasukkan sampel 0,025 mL dan

ditambahkan 3mL larutan amilum. Lalu microplate diinkubasi selama 7
menit. Ditambahkan 0,5 mL HCl , 4 mL aquadest dan 0,05 pereaksi lugol.
Serapan dibaca pada panjang gelombang 627 nm.

VII. Data Pengamatan dan Perhitungan

No. Perlakuan Hasil

1 Preparasi Sampel

 Ditimbang 25 gr sampel buah apel dan Diperoleh supernatan

digerus hingga halus sampel yang berada di
 Ditambahkan aquadest hingga volume 50 mL atas dan endapan sampel
  Dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi yang berada di bawah
dan di lakukan sentrifugasi dengan kecepatan tabung sentrifugasi.
3000 rpm selama 10 menit
2. Pembuatan pereaksi
 Amilum 0,5% 100 mg amilum dilarutkan
Didapat larutan amilum
dalam 20 ml aquades, dipanaskan. Larutan
0,5 %
didinginkan dan digenapkan 20 ml dengan
aquades (5000 rpm).
 Dibuat lugol 0,015% dengan melarutkan 300
mg KI dalam 10 ml aquades dan ditambah 30
mg I2 lalu ditambakan aquadest hingga 20 Didapat larutan lugol
ml. 0,015%

 Dimasukkan larutan HCl pekat sebanyak 30

mL, ke dalam labu ukur 100 mL yang telah
terisi 50 mL aquadest lalu ditambahkan
aquadest hingga mencapai 100 mL

Didapat larutan HCl 30%

sebanyak 100 mL

3. Pembuatan Kuva Baku

 Amilum 500 ppm diambil sebanyak 0,1 mL ; Didapat persamaan kurva

0,2 ml ; 0,3 mL ; 0,4 mL ; dan 0,5 mL baku dari absorbansi
 Masing-masing amilum ditambahkan 0,5 mL blanko yaitu y = 0,0004x
HCl, 4 mL aquadest, dan 0,5 mL lugol. + 0,2761 dan regresi
2
 Diukur absorbansi pada panjang gelombang sebesar r = 0,9607
627 nm.
4. Uji Amilase

 Dimasukkan sampel 0,025 mL dan Didapatkan sisa amilum

ditambahkan 3mL larutan amilum ke dalam sebanyak 5986,41 ppm,
microplate Amilum yang
 Diinkubasi microplate selama 7 menit. terhidrolisis sebesar
 Ditambahkan 0,5 mL HCl , 4 mL aquadest 2013,59 ppm dan
dan 0,05 pereaksi lugol. aktivitas enzim yang

 Serapan dibaca pada panjang gelombang 627 terbaca yaitu 4,754

nm ppm/s

Perhitungan
a. Pembuatan Pereaksi
 Amilum 0,5%
0,5
0,5% = 100 × 20 ml = 0,1 gr = 100 mg

 Iodium 0,15%
I2 = 30 mg
30 mg
 1% = 1 gram / 100 ml
20 ml
0,03 gr
× 100% = 0,15%
20 ml

 HCl 30%
N1 × V1 = N2 × V2
37% × V1 = 30% × 100 ml
V1 = 81,081 ml
V1 = 81 ml add 100 ml aquades
b. Absorbansi Blanko

Kurva 5 titik
Persmaan  y = 0,0004x + 0,2761
R2 = 0,9607
 Percobaan 1 = 2,935  Abs = 2,935 – 0,117
= 2,818
y = 0,0004x + 0,2761
2,818 = 0,0004x + 0,2761
x = 6354,75 ppm
 Percobaan 2 = 1,704  Abs = 1,704 – 0,117
= 1,587
y = 0,0004x + 0,2761
1,587 = 0,0004x + 0,2761
 x = 3277,25 ppm
 Percobaan 3 = 3,724  Abs = 3,724 – 0,117
= 3,607
y = 0,0004x + 0,2761
3,607 = 0,0004x + 0,2761
x = 8327,25 ppm

6354,75+3277,25+8327,25
x rata-rata = = 5986,41 ppm
3

VIII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian aktivitas enzim amilase

yang terkandung pada buah-buahan dan sayur-sayuran menggunakan metode
kolorimetri dengan pereaksi lugol. Sampel yang digunakan adalah buah apel.
Tujuan dilakukannya pengujian ini adalah untuk mengetahui baik atau
buruknya aktivitas enzim amilase yang terkandung di dalam buah apel tersebut.
Penentuan aktivitas enzim amilase dilakukan berdasarkan jumlah gula reduksi
yang dilepaskan dan kemudian diukur secara kolorimetri. Metode kolorimetri
ini merupakan metode yang didasari oleh tercapainya kesamaan besarnya
warna antara sampel dengan larutan standar, yang mana menggunakan sumber
cahaya polikromatis serta detector yang nantinya akan diketahui absorbansinya
melalui komputer.

Prinsip yang mendasari praktikum kali ini adalah aktifitas enzim

amilase, kolorimetri dan hukum Lambert-Beer. Langkah awal yang harus
dilakukan sebelum memulai pengujian adalah menyiapkan alat dan bahan yang
dibutuhkan dalam praktikum ini. Kemudian membuat larutan pereaksi,
menyiapkan larutan blanko, serta preparasi sampel. Pereaksi atau reagen yang
digunakan dalam praktikum kali ini antara lain ada larutan Amilum 0,5% ,
larutan Lugol 0,015%, serta larutan HCl 30%. Dalam pembuatan larutan
Amilum 0,5% dolakukan dengan melarutkan amilum sebanyak 100 mg ke
dalam 20 ml air yang dipanaskan hingga seluruh amilum larut. Setelah amilum
larut dengan sempurna, kemudian larutan amilum perlu didinginkan terlebih
dahulu sebelum digunakan. Kemudian, dalam pembuatan Larutan Lugol
0,015% dilakukan dengan cara melarutkan KI sebanyak 300 mg. Lalu,
menimbang 30 mg I2. KI dengan I2 yang telah ditimbang kemudian dilarutkan
dalam 20 ml aquades. Sedangkan, untuk membuat larutan HCl 30% adalah
dengan cara mengencerkan larutan HCl 37% sebanyak 81 ml dengan aquadest
hingga mencapai 100 ml.

Setelah selesai menyiapkan larutan pereaksi, kemudian dilakukan

preparasi sampel. Dalam preparasinya, perlu diketahui bahwa pengujian
dilakukan untuk melihat aktivitas enzim amilase pada masing-masing bahan
uji. Maka sampel, dalam hal ini buah dan sayur, harus dalam keadaan diambil
sari- sarinya. Sampel dipotong menjadi berukuran kecil dan kemudian
ditimbang 25 gram untuk kemudian ditambahkan 25 ml air. Untuk mengambil
sari-sari buah apel (sampel kelompok 1), apel digerus dalam mortir dan
diblender hingga halus lalu disaring dengan kertas saring. Hasil saringan
dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi untuk disentrifugasi. Prinsip proses
sentrifugasi adalah pemisahan dengan kecepatan tinggi. Setelah proses ini,
terlihat sampel menjadi bening dan ampas dari buah apel terkumpul di bawah
tabung sentrifugasi seperti endapan. Sari-sari buah apel inilah yang akan
dimasukkan ke dalam microplate untuk kemudian diihat aktivitas amilasenya.
Amilase sendiri merupakan enzim yang berperan penting dalam bidang
bioteknologi, terutama pada bidang pangan. Aktivitas enzim ini bergantung
pada konsentrasi enzim dan juga keadaan saat reaksi terjadi seperti pH dan
suhu. Dengan spektrofotometri juga dapat dilihat aktivitas spesifik, jumlah unit
enzim per mg protein ataupun besarnya aktivitas enzim per jumlah protein yang
terkandung dalam pengujian. Makin besar aktifitas spesifik enzimnya, maka
besar tingkat kemurnian suatu enzim akan semakin besar.

Dapat dilihat, setelah sari-sari buah apel mulai dimasukkan

menggunakan micropipet ke dalam microplate dan dimasukkan ke dalam alat
spektrofotometri bersama dengan kurva baku, kontrol, amilase atau enzimnya,
dan lugol atau indikator untuk amilum akan terjadi proses penyerapan cahaya
atau absorbansi cahaya yang dapat dianalisis datanya. Sebelumnya,
dimasukkan juga HCl dalam microplate bersama sampel. Enzim akan aktif bila
ada reaksi untuk mempercepat reaksi itu terjadi. Sedangkan, reaksi itu bila terus
terjadi pada saat pengujian maka tidak akan didapat data. Spesifiknya pada
pengujian ini, ingin dilihat aktivitas amilasenya maka harus ada sisa amilase
yang dapat diabsrobsi oleh cahaya dari spektrofotometer dan dianalisis aktivitas
dari amilase. Maka, dibutuhkan HCl dengan tujuan menghentikan proses
penguraian pati atau hidrolisis pati dengan cara mendenaturasi protein.
Penambahan HCl ini akan memberi elektrolit Cl- agar efektifitas dari enzim
amilase berkurang dan juga memberikan suasana asam dan membuat aktifitas
lugol akan memberi warna pada larutan. Nantinya, lugol tidak akan mewarnai
sampel yang kadar patinya masih utuh. Tetapi, lugol akan mulai mewarnai
sampelnya ketika pati yang tersisa sudah dihentikan hidrolisisnya oleh enzim
amilase dengan HCl. Berdasarkan literatur, prinsip spektrofotometer itu dapat
mengukur absorbansi bila larutan berwarna dan bening. Maka, absorbansi dari
sampel dapat terlihat ketika sampel sudah bercampur dengan lugol dan lugol
sudah memberikan warna kebiruan pada sampel.

Wadah yang diperlukan untuk menampung sampel di dalam

spektroskopi adalah microplate. Sebenarnya kuvet juga dapat dijadikan sebagai
wadah untuk absorbansi, tetapi disini digunakan spektroskopi yang menyerap
sinar UV. Sedangkan untuk kuvet digunakan dalam spetrosfotometer Vis atau
Visible. Untuk pembacaan absorbansinya sendiri, microplate dapat digunakan
 bila kita ingin melihat banyak absorbansi dalam sekali uji. Bila menggunakan
kuvet, hanya bisa melihat absorbansi untuk 2 tempat saja, biasanya 2 tempat
itupun hanya satu yang digunakan untuk menampung sampel, kuvet lain
digunakan untuk kurva baku.

Pada pengujian amilase ini, didapat data amilum yang tersisa adalah
5986,41 ppm dan amilum yang terhdrolisis adalah 2013,59 ppm, jadi didapat
aktivitas enzim amilase pada sari buah apel 4754 ppm/second. Dilihat dari data
absorbansi yang sudah terbaca, absorbansi tidak hanya dapat mengukur sampel
secara kualitatif tapi juga secara kuantitatif. Percobaan kali ini menunjukkan
semakin banyak atau semakin besar absorbansi yang didapat maka aktivitas
enzim amilase kurang maksimal, sedangkan bila nilai absorbansi semakin
sedikit atau semakin kecil maka aktivitas enzim amilase dalam sampel semakin
baik. Hal ini dikarenakan, nilai absorbansi yang dihasilkan adalah merupakan
hasil dari absorbsi amilum sisa dari penguraian oleh enzim amilase. Absorbansi
bukan hasil dari absorbsi amilum awal ketika dimasukkan ke dalam
spektroskopi. Karena itu, dimasukkan kurva baku agar faktor koreksi untuk
perhitungan energi kinetik dari aktivitas enzim amilase ini dapat terpenuhi.
Maka dari itu, nilai kurva baku dengan 5 titik uji harus mendekati 1 atau 0,99.

IX. Kesimpulan
Dalam pengujiannya, aktivitas amylase dapat diketahui dari kadar sisa
amilum yang masih terdapat dalam sampel. Menurut data hasil percobaan,
kadar sisa amilum adalah sebesar 5986,41 ppm dan didapatkan aktivitas
amylase yaitu 4,794 ppm/second.
 DAFTAR PUSTAKA

Aiyer, P.V. 2005. Amylases and Their Applications. African Journal of Biotechnology,
Vol 4 No. 2:125– 1529.

Akpan, I. & Adelaja, F.A. 2003. Production and Stabilization of Amylase Preparations
from Rice Bran Solid Medium. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 20:47-50.

Ateng Supriyatna, Dea Amalia, Ayu Agustini Jauhari, Dyna Holydaziah. 2015.

Aktivitas Enzim Amilase, Lipase, dan Protease dari Larva. Available at:
journal.uinsgd.ac.id/index.php/istek/article/download/186/201. [Accessed on
14th May 2018].

Fitriani, A., Supriyanti, F.M.T., dan Heryanto, T.E. 2013. Penentuan Aktivitas
Amilase Kasar Termofil Bacillus subtilis Isolat Kawah Gunung Darajat Garut,
Jawa Barat. Bionatura-Jurnal Ilmu-ilmu Hayati dan Fisik. Vol. 15, No. 2: 107
- 113

Illaneus, A. 2008. Enzyme Biocatalysis Principle and Applications. Springer Science:

Business Media B.V.

Lehninger, A.L., 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Lestari, F. 2007. Bahaya Kimia: Sampling dan Pengukuran Kontaminan di Udara.

Jakarta: EGC.
Marks, D.B.A.D., Marks, C.M., Smith. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah
Pendekatan Klinis. Jakarta: EGC.

Megiandari, A. 2009. Isolasi Dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik Dari Usus
Biawak Air [Tesis] Jurusan Kimia FMIPA. IPB. Bogor.
Mufti M., Seniwati Dali, Rugaiyah Arfah, dan Firdaus Zenta. 2013. Isolasi dan
Karakterisasi Enzim Amilase dari Akar Rimpang Alang-Alang (Imperata
cylindrica). Available at:
repository.unhas.ac.id/bitstream/handle/123456789/8692/jurnalpublikasimufti
.pdf?. [Accessed on 19th May 2018].
Wijayanti, N. 2017. Fisiologi Manusia dan Metabolisme Zat Gizi. Malang: UB Press.