LAPORAN PRAKTIKUM

ENZIMOLOGI

ACARA PRAKTIKUM KE : II
UJI AKTIVITAS AMILASE SECARA KUANTITATIF

Nama : Matthew Arriel Christiano Loedji

NIM : 24020220130061
Kelompok :1
Hari, tanggal : Rabu, 17 November 2021
Asisten : Immaculata Stefanie

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2021
 ACARA II
UJI AKTIVITAS AMILASE SECARA KUANTITATIF

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum maka mahasiswa akan mampu menguji aktivitas amil
ase pada sampel secara kuantitatif.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Enzim Amilase
Amilase adalah enzim pencernaan yang sebagian besar disekresikan oleh
pankreas dan kelenjar ludah dan ditemukan di jaringan lain dalam jumlah yang
sangat kecil. Amilase pertama kali dijelaskan pada awal 1800-an dan dianggap
sebagai salah satu enzim pertama dalam sejarah yang diselidiki secara ilmiah.
Awalnya disebut sebagai diastaste tetapi kemudian berganti nama menjadi
amilase pada awal abad ke-20. Fungsi utama amilase adalah menghidrolisis
ikatan glikosidik dalam molekul pati, mengubah karbohidrat kompleks menjadi
gula sederhana. Ada tiga kelas utama enzim amilase yaitu Alpha-, beta- dan
gamma-amilase, dan masing-masing bekerja pada bagian yang berbeda dari
molekul karbohidrat. Alpha-amilase dapat ditemukan pada manusia, hewan,
tumbuhan, dan mikroba. Beta-amilase ditemukan pada mikroba dan tanaman.
Gamma-amilase ditemukan pada hewan dan tumbuhan (Azzopardi et al, 2016).
2.2. Aktivitas Enzim Amilase
Mekanisme kerja enzim α-amilase terdiri dari dua tahap, yaitu tahap
pertama degadasi amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang terjadi secara
acak. Degadasi ini terjadi sangat cepat dan diikuti dengan menurunnya
viskositas dengan cepat. Tahap kedua terjadi pembentukan glukosa dan maltosa
sebagai hasil akhir dan tidak acak. Keduanya merupakan kerja enzim α-amilase
pada molekul amilosa. Pada molekul amilopektin kerja α-amilase akan
menghasilkan glukosa, maltosa dan satu seri α-limit dekstrin, serta oligosakarida
yang terdiri dari empat atau lebih glukosa yang mengandung ikatan α-1,6-
glikosidik (Winarno, 2010).
2.3. Uji Kuantitatif Enzim Amilase
 Ada dua jenis tes yang digunakan untuk menentukan aktivitas α-amilase
dan glukoamilase. Satu didasarkan pada pengukuran jumlah gula pereduksi
dengan uji asam dinitrosalisilat (DNS) atau metode Nelson-Somogyi, sedangkan
yang lainnya didasarkan pada penurunan nilai pewarnaan kompleks pati-iodin
biru. Metode kedua, yang dikembangkan oleh Fuwa dan digunakan secara luas,
didasarkan pada perkembangan warna yang dihasilkan dari ikatan yodium
dengan pati polimer. Namun, uji pati-yodium yang dilaporkan oleh peneliti yang
berbeda cukup beragam dengan konsentrasi yodium mulai dari 3 M hingga 0,25
mM dan dengan panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur
perkembangan warna bervariasi dari 550 nm hingga 700 nm. Selain itu, aktivitas
α-amilase dihitung sebagai aktivitas relatif menurut persamaan berikut. Aktivitas
Dekstrinisasi = (D0-D) ÷ D0 × 100 ÷ 10, dengan D adalah absorbansi sampel
enzim dan D0 adalah absorbansi amilosa kontrol tanpa penambahan enzim (Xiao
et al, 2017).
2.4. Amilum
Amilum merupakan campuran dua macam stuktur polisakarida yang
berbeda yaitu amilosa (17-20%) dan amilopektin (83- 80%). Amilum juga
didefinisikan sebagai karbohidrat yang berasal dari tanaman, sebagai
hasilfotosintesis, yang disimpan dalam bagian tertentu tanaman sebagai
cadangan makanan. Sifatnya yang inert dan dapat tercampurkan dengan
sebagian besar bahan obat merupakan kelebihan dari amilum sebagai eksipien.
Amilum yang sering digunakan dalam industri farmasi dapat dibagi menjadi 2
yaitu amilum alami dan amilum modifikasi. Amilum alami (native starch)
adalah amilum yang dihasilkan dari sumber umbi-umbian dan belum mengalami
perubahan sifat fisika dan kimia atau diolah secara fisika-kimia. Amilum
termodifikasi merupakan suatu amilum yang sudah diproses secara kimiawi
maupun mekanis, sehingga diharapkan akan diperoleh amilum yang mempunyai
sifat alir dan kompaktibilitas yang lebih baik dari amilum asalnya sehingga
dapat digunakan sebagai eksipien (Priyanta et al, 2015).
2.5. Larutan Dinitrosalycilic acid (DNS)
Asam 3,5-dinitrosalisilat adalah asam monohidroksibenzoat yang terdiri
dari asam 2-hidroksibenzoat yang memiliki substituen nitro pada posisi 3 dan 5.
Senyawa ini digunakan dalam pengujian kolorimetri untuk keberadaan gugus
karbonil bebas (C=O) dalam gula pereduksi. Senyawa ini memiliki peran
sebagai hapten. Senyawa ini adalah senyawa C-nitro dan asam
monohidroksibenzoat. Senyawa ini berasal dari asam salisilat (PubChem, 2021).
III. METODE
3.1 Alat
1. Erlenmeyer
2. Tabung reaksi
3. Rak
4. Spektrofotometer
5. Penangas air

3.2 Bahan
1. Larutan glukosa/maltose
2. Pereaksi DNS
3. Larutan pati 1%
4. Amilase dengan beberapa konsentrasi
5. Buffer fosfat pH 6,9

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Membuat Larutan Standar
1. Larutan glukosa dibuat dengan konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1
mg/ml sebanyak 50 ml.
2. Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebany
ak 1 ml.
3. Pereaksi DNS ditambahkan sebanyak 1,5 ml dan diinkubasi pada s
uhu 37oC selama 5 menit, lalu didinginkan dengan air mengalir.
4. Absorbansinya diukur menggunakan spektrofotometer pada panjan
g gelombang 540 nm.
5. Hasil absorbansinya dibuat kurva standar sehingga menghasilkan p
ersamaan linier.

3.3.2 Uji Aktivitas Amilase

1. Larutan pati 0,5% disiapkan dengan cara melarutkan 0,25 g amilum
ke dalam 50 ml aquades.
 2. Larutan enzim α-amilase disiapkan dengan konsentrasi tertentu dal
am buffer fosfat pH 6,9.
3. Sebanyak 1 ml larutan pati 0,5% diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi baru lalu ditambahkan enzim α-amilase sebanyak 0,5
ml.
4. Larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC dan dilakukan
reaksi di atas untuk larutan substrat tanpa enzim.
5. Setelah inkubasi selama 10 menit, reaksi dihentikan dengan mena
m-bahkan 2 ml pereaksi asam dinitrosalisilat (DNS) ke dalam tabu
ng reaksi tadi.
6. Campuran reaksi dipanaskan menggunakan penangas selama 5 men
it.
7. Nilai absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelo
mbang 540 nm.
8. Nilai absorbansi tersebut digunakan untuk menghitung jumlah gula
reduksi yang dihasilkan dari reaksi di atas menggunakan kurva stan
dar maltosa. Nilai absorbansi terkoreksi adalah Abs A-Abs B.
9. Aktivitas amilase dihitung dengan menggunakan rumus:

Aktivitas Enzim (Unit/mL) = Y x 1000 x Faktor pengenceran

10x BM Maltosa

(Y = jumlah gula reduksi yang dihasilkan dalam miligram, yang

dihitung berdasarkan kurva standar maltosa)
IV. HASIL PENGAMATAN
4.1 Larutan Standar
X (Konsentrasi) Y (OD/Absorbansi)
0,0 0,75
0,2 1,28
0,4 1,56
0,8 2,00
1,0 2,46
1,2 2,87

Kurva Larutan Standar

3.5

2.5

2
Absorbansi

Kurva Linear Standar

1.5

0.5

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Konsentrasi

4.2 Perhitungan Aktivitas Enzim

a. Menghitung nilai Absorbansi jika diketahui nilai Transmisi = 8,6
A = 2 - Log T
A = 2 - Log 8,6
A = 1,06550154876

b. Menghitung nilai konsentrasi sampel

Y = 0,2514x - 0,28
1,07 + 0,28 = 0,2514x
1,35 = 0,2514x
X = 1,35/0,2514
X = 5,369

Faktor pengenceran = 6
Aktivitas Enzim = Y x 1000 x Faktor pengenceran
10 x BM Glukosa
= 5,36 x 1000 x 6
10 x 180
= 17,86
V. PEMBAHASAN
Praktikum Enzimologi Acara ke II yang berjudul “Uji Aktivitas Amilase seca
ra Kuantitatif” memiliki tujuan setelah melakukan praktikum maka mahasiswa akan
mampu menguji aktivitas amilase pada sampel secara kuantitatif. Praktikum ini dila
ksanakan secara daring menggunakan aplikasi Microsoft Teams pada hari Rabu, 17
November 2021.
Dalam praktikum ini, beberapa tahapan memiliki persamaan dengan
penelitian Wahjuni et al (2017). Metode yang digunakan dalam penelitian tersebut
ditentukan dengan menggunakan reagen DNS menggunakan metode
spektrofotometri. Sampel disiapkan dengan mereaksikan 1 mL enzim dengan 1 mL
substrat dalam 0,2M buffer fosfat pH 7 dan divortex untuk menghomogenkan
larutan, kemudian diinkubasi pada temperatur 70°C selama 20 menit. Lalu ke dalam
sampel (1 mL) ditambahkan 1,5 mL reagen DNS. Campuran dihomogenisasi
dengan vorteks dan suhu dinaikkan pada 100°C selama 10 menit. Setelah itu,
campuran didinginkan pada suhu ruang selama 20 menit dan diukur absorbansinya
pada panjang gelombang maksimum 515,6 nm. Aktivitas enzim amilase dinyatakan
dalam unit per mL, di mana satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1,0 µmol gula pereduksi per menit di bawah
kondisi pengujian. Tiap sampel pengujian aktifitas enzim dibuat ulangannya
sebanyak tiga kali.
Pembuatan kurva standar didapatkan dengan adanya hubungan antara
penyerapan cahaya (absorbansi) dengan konsentrasi total gula, yang dimaksudkan
untuk menghasilkan persamaan linier. Persamaan linier inilah yang nantinya akan
menjadi data penentuan untuk menentukan nilai x yang nantinya akan diolah
datanya untuk menentukan aktivitas suatu enzim. Kurva Standar hasil absorbansi
dari larutan standar yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
540 nm dibuat menjadi kurva standar. Nilai-nilai absobansi yang diperoleh dan
konsentrasi dari larutannya dimasukkan pada Ms. Excel dan dibuat kurva
standarnya. X pada kurva standar adalah konsentrasi dari larutan glukosa dan Y
adalah absorbansinya. Dalam penelitian Melisha et al (2016), perhitungan aktivitas
enzim dilakukan dengan mensubstitusikan absorbansi larutan yang diperoleh pada
pengujian aktivitas enzim ke dalam persamaan regresi kurva kalibrasi larutan
standar glukosa.
Dalam praktikum ini, untuk mengukur unit aktivitas amilase digunakan
Y x 1000 x Faktor pengenceran
rumus: . Y pada rumus adalah nilai absorbansi.
10 x BM Glukosa
Faktor pengenceran pada praktikum ini adalah 6, yang didapat dari jumlah
keseluruhan dari volume larutan yang dipakai. BM glukosa adalah berat molekul
dari glukosa yaitu 180 g/mol sehingga didapatkan hasil pengukuran aktivitas enzim
17,86 mg/Ml. Dalam penelitian Susilawati et al (2015), aktivitas amilase dihitung
berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai volume glukosa yang dihasilkan oleh
1 mL filtrat kasar amilase. Besarnya satu unit aktivitas enzim dapat dihitung
MG x 1000
menggunakan rumus sebagai berikut: AE= dengan keterangan AE yaitu
BMG x MI
aktivitas enzim (Unit/mL), MG yaitu miligram glukosa yang dihasilkan dari reaksi
hidrolisis pati, BMG yaitu berat molekul glukosa (180), dan MI yaitu masa inkubasi
(20 menit).
VI. KESIMPULAN
Amilase adalah enzim pencernaan yang sebagian besar disekresikan oleh
pankreas dan kelenjar ludah dan ditemukan di jaringan lain dalam jumlah yang
sangat kecil. Fungsi utama amilase adalah menghidrolisis ikatan glikosidik dalam
molekul pati, mengubah karbohidrat kompleks menjadi gula sederhana. Nilai
absorbansi yang diperoleh adalah 1,06550154876. Nilai konsentrasi sampel yang
diperoleh adalah 5,369. Nilai unit aktivitas amilase yang diperoleh adalah 17,86
mg/mL.
 DAFTAR PUSTAKA

Azzopardi, E., Lloyd, C., Teixeira, SR., Conlan, RS., Whitaker, IS. Clinical Application
of Amylase: Novel Perspectives. Surgery. 160(1):26-37.
Priyanta, Rissang., Arisanti, Cokorda., Anton, Jemmy. 2015. Sifat Fisik Granul Amilum
Jagung yang Dimodifikasi Secara Enzimatis Dengan Lactobacilus acidophilus
Pada Berbagai Waktu Fermentasi. Farmasi. 1(1):1-8.
Melisha, Harpeni., Esti., Supono. 2016. Produksi dan Pengujian Aktivitas Amilase
Burkholderia cepacia Terhadap Substrat yang Berbeda. e-JRTBP. 5(1):559-566.
National Center for Biotechnology Information (2021). PubChem Compound Summary
for CID 11873, 3,5-Dinitrosalicylic acid. Retrieved November 17, 2021
from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3_5-Dinitrosalicylic-acid.
Susilawati, Ika., Batubara, Ummi., Riany, Hesti. 2015. Analisis Aktivitas Enzim
Amilase yang Berasal dari Bakteri Tanah di Kawasan Universitas Jambi.
Prosiding Semirata 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat. 1(1):359-367.
Wahjuni, Sri., Suarya, Putu., Saputra, I. 2017. Isolasi Enzim Amilase dari Kecambah
Biji Jagung Lokal Seraya (Zea mays L.) untuk Hidrolisis Pati. Jurnal Kimia.
11(2):122-128.
Winarno, F.G. 2010. Enzim Pangan. Bogor: M-Brio Press.
Xiao, Zhizhuang., Storms, Reginald., Tsang, Andrian. 2017. A quantitative starch–
iodine method for measuring alpha-amylase and glucoamylase activities.
Analytical Biochemistry. 1(1):1-4.
 LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 17 November 2021

Asisten, Praktikan,

Immaculata Stefanie Matthew Arriel CL

(NIM) NIM. 24020220130061