0 penilaian0% menganggap dokumen ini bermanfaat (0 suara)
79 tayangan6 halaman
1. Metode untuk menganalisis aktivitas enzim amilase umumnya melibatkan pengukuran hasil hidrolisis pati oleh enzim menjadi monosakarida.
2. Tiga metode yang dijelaskan memiliki prinsip yang sama yaitu mengukur sisa substrat pati setelah bereaksi dengan enzim amilase selama waktu tertentu.
3. Hasil hidrolisis diukur menggunakan larutan iodin yang memberi warna pada sisa pati atau men
1. Metode untuk menganalisis aktivitas enzim amilase umumnya melibatkan pengukuran hasil hidrolisis pati oleh enzim menjadi monosakarida.
2. Tiga metode yang dijelaskan memiliki prinsip yang sama yaitu mengukur sisa substrat pati setelah bereaksi dengan enzim amilase selama waktu tertentu.
3. Hasil hidrolisis diukur menggunakan larutan iodin yang memberi warna pada sisa pati atau men
1. Metode untuk menganalisis aktivitas enzim amilase umumnya melibatkan pengukuran hasil hidrolisis pati oleh enzim menjadi monosakarida.
2. Tiga metode yang dijelaskan memiliki prinsip yang sama yaitu mengukur sisa substrat pati setelah bereaksi dengan enzim amilase selama waktu tertentu.
3. Hasil hidrolisis diukur menggunakan larutan iodin yang memberi warna pada sisa pati atau men
B. Deteksi enzim amilase (Laloknam et. al, 2009) 1. 50 l filtrat sampel ditambahkan pada lubang-lubang dalam starch agar (2.0 % agar dan 1% pati, pH 7.0). 2. Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. 3. Larutan iodin ditambahkan pada agar sehingga terlihat daerah terang yang terbentuk. 4. Diameter daerah terang di sekitar lubang-lubang pada agar diukur. 5. Dapat pula diukur aktivitas amilase berdasarkan selisih antara diameter daerah terang disekitar lubang dengan diameter lubang pada agar.
C. Uji aktivitas enzim amilase AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007) 1. 1 ml filtrat enzim hasil ekstraksi ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat/ pati (soluble starch). 2. Diinkubasi selama 3 menit pada suhu optimum 30 0 C. 3. Ditambah dengan 2 ml DNS (3,5 dinitro salicilic acid) kemudian dipanaskan sampai mendidih, didinginkan cepat pada air mengalir dan ditambah 20 ml aquades. 4. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.
Aktivitas enzim alfa-amilase = C x 1/T x 1 unit/1 mikromol
dimana: C = konsentrasi maltosa per ml ekstrak enzim (mikromol) T = waktu inkubasi (menit) 1 unit enzim -amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 mikromol maltosa per menit per ml enzim
Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993) 1. Ke dalam tabung-tabung percobaan (sampel dan blanko), dimasukkan 2 ml larutan substrat pati dalam buffer asetat pH 6,0 ditempatkan pada penangas air dengan temperatur 37 0 C selama 5 menit. 2. Campuran ditambah 0,05 ml larutan enzim memakai pipet, dikocok beberapa lama, lalu diinkubasi pada temperatur 37 0 C selama 15 menit. 3. Setelah campuran diinkubasi, dengan segera ditambahkan 20 ml aquades dan 1,0 ml larutan I 2 0,008 N. 4. Campuran dikocok beberapa lama hingga tercampur sempurna. 5. Dibiarkan 10 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm. * Larutan substrat yang digunakan mengandung 0,2 gr Amilosa, 15mM NaCl dan 20 mM buffer asetat pH 6,0. * Perhitungan memakai satuan Street-Close/ 100 ml. * Satu satuan S.C. = jumlah enzim yang dapat menghidrolisis 20 mikromol amilosa dalam waktu 15 menit pH 6,0 dengan temperatur 37 0 C.
Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009) 1. Gelatinisasi larutan pati yang digunakan untuk substrat. - Sebanyak 40 ml larutan pati 1% (Soluble starch) ditambahkan dalam 50 ml air medidih di gelas beaker sambil diaduk. - Larutan kemudian didinginkan hingga mencapai suhu ruang. - Ditambah dengan aquades hingga volume tepat 100 ml. 2. Pembuatan larutan baku/ standar (stock solution) - Larutan gelatinisasi pati diambil sebanyak 1 ml. - Ditambah aquades hingga volume tepat 100 ml kemudian dihomogenkan. 3. Pembuatan Kurva Standar dan Uji Amilase - Larutan baku diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan dalam 3 tabung reaksi. - Ditambah 3 ml buffer fosfat 0,1 M pH 5,6. - Ditambah 1,5 ml ekstrak amilase dan campuran diinkubasi pada suhu 37C. - Setelah diinkubasi, campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada tabung reaksi yang berisi 3 ml HCl 10% untuk menghentikan reaksi. - Ditambah 3 ml indikator (larutan iodin kalium iodida). - Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm. - Prosedur diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. - Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.
C. Analisa Prosedur Aktivitas alfa-amilase secara umum ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnaan iodium terhadap substrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bereaksi dengan iodium berwana coklat. Keaktifan alfa-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986). Metode untuk analisa enzim amilase di atas memiliki prinsip yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu. 1. Analisa 2. Analisa Prosedur Deteksi Enzim Amilase: Prinsip utama dalam mendeteksi keberadaan enzim amilase adalah hidrolisis pati (starch) yang ditandai dengan daerah terang pada agar di sekitar lubang yang telah ditetesi sampel. Starch agar yang dibuat mengandung pati yang merupakan karbohidrat kompleks. Enzim amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase dapat mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Enzim amilase pada sampel akan menghidrolisis pati pada agar. Hal ini dapat diketahui dengan terlihatnya daerah terang pada starch agar. Penambahan larutan iodin pada agar bertujuan untuk memperjelas daerah terang yang terbentuk. Aktivitas enzim amilase masing-masing sampel juga dapat ditentukan dengan perbandingan diameter daerah terang yang terbentuk pada agar. 3. Analisa Prosedur Uji Aktivitas Enzim Amilase: AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007) Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 3 menit dan suhu optimum 30 o C. Reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilic acid). Selain itu reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) akan bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan mengakibatkan terbentuknya warna tertentu. Sampel kemudian didihkan agar reagen DNS dapat bekerja dengan cepat, setelah itu didinginkan dengan air mengalir. Penambahan 20 ml akuades untuk pengenceran sampel. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Metode ini terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara konsentrasi glukosa dalam berbagai macam konsentrasi dan absorbansi. Kemudian konsentrasi sampel yang didapat melalui kurva standar dimasukkan ke dalam rumus untuk mendapatkan aktivitas enzim amilase. Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993) Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 5 menit dan suhu optimum 37 o C. Penambahan akuades sebanyak 20 ml bertujuan untuk mengencerkan sampel. Setelah itu, ditambahkan larutan I 2 . Larutan I 2 akan bereaksi dengan sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim amilase dan menghasilkan warna biru. Semakin banyak pati yang tersisa berarti aktivitas enzim amilase semakin kecil, dengan ditandai dengan degradasi warna biru. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Aktivitas enzim diukur dengan memasukkan nilai absorbansi ke dalam rumus, dengan satuan aktivitas enzim adalah S.C. (Street-Close). Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009) Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi atau likuifikasi pati sehingga menghasilkan larutan starch yang baku. Larutan ini kemudian digunakan sebagai substrat dalam mereaksikan dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu tertentu dan suhu optimum 37 o C. Reaksi ini kemudian dhentikan dengan menambahkan larutan HCl 10%. Setelah itu ditambahkan indikator iodin-kalium iodida. Menurut Teodoro dan Meire (2000), larutan indikator dibuat dengan 0,05% iodin dalam 0. 5% KI. Sisa pati yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator sehingga menghasilkan warna tertentu. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Proses tersebut merupakan pengukuran pada jam ke-0. Langkah pengujian aktivitas enzim diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu kemudian diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.
Uji Aktivitas Protease Uji aktivitas protease berdasarkan metode Kunitz. 0,5 mL substrat kasein 0,5% dan 1 mL aqudes dimasukkan ke dalam tabung sampel dan kontrol, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 35 o C. 4,3 mL TCA 3,5% ditambahkan pada tabung kontrol, dan 0,1 mL larutan enzim ditambahkan pada tabung sampel. Inkubasi dilanjutkan selama 30 menit. Lalu reaksi enzimatik pada tabung sampel dihentikan dengan menambah 4,3 mL TCA 3,5%. Aktivitas enzim ditetapkan dengan mengukur absorbansi produk hasil reaksi pada