Sanger Sequencing

Sanger sequencing adalah metode sekuensing DNA yang pertama kali dikomersialkan
oleh Applied Biosystems, berdasarkan pada penggabungan selektif dari dideoxynucleotides
pemutusan rantai oleh DNA polimerase selama replikasi DNA in vitro. [1] [2] Dikembangkan
oleh Frederick Sanger dan rekan pada tahun 1977, itu adalah metode sekuensing yang paling
banyak digunakan selama sekitar 40 tahun. Baru-baru ini, sekuensing volume Sanger yang lebih
tinggi telah digantikan oleh metode sekuensing "Next-Gen", terutama untuk analisis genom skala
besar dan otomatis. Namun, metode Sanger tetap digunakan secara luas, untuk proyek skala
kecil, dan untuk validasi hasil Next-Gen. Ia masih memiliki keunggulan dibandingkan teknologi
sekuens baca-pendek (seperti Illumina) sehingga dapat menghasilkan pembacaan sekuens DNA>
500 nukleotida.
 Metode terminasi rantai klasik membutuhkan templat DNA beruntai tunggal, primer
DNA, DNA polimerase, deoxynucleotidetriphosphate normal (dNTPs), dan modifikasi di-
deoxynucleotidetriphosphate (ddNTPs), yang terakhir yang mengakhiri perpanjangan untai
DNA. Nukleotida pemutusan-rantai ini tidak memiliki gugus 3'-OH yang diperlukan untuk
pembentukan ikatan fosfodiester antara dua nukleotida, menyebabkan DNA polimerase untuk
menghentikan perpanjangan DNA ketika ddNTP yang dimodifikasi dimasukkan. DdNTPs dapat
dilabel secara radioaktif atau fluoresensi untuk dideteksi pada mesin pengurutan otomatis.

Sampel DNA dibagi menjadi empat reaksi sekuens terpisah, yang mengandung keempat
deoksinukleotida standar (dATP, dGTP, dCTP dan dTTP) dan DNA polimerase. Untuk setiap
reaksi ditambahkan hanya satu dari empat dideoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau
ddTTP), sedangkan nukleotida lain yang ditambahkan adalah yang biasa. Konsentrasi
dideoxynucleotide harus kira-kira 100 kali lebih rendah daripada deoxynucleotide yang sesuai
(mis. 0,005mM ddTTP: 0,5mM dTTP) untuk memungkinkan fragmen yang cukup untuk
diproduksi sementara masih menyalin urutan lengkap. [2] Menempatkannya dalam urutan yang
lebih masuk akal, empat reaksi terpisah diperlukan dalam proses ini untuk menguji keempat
ddNTP. Mengikuti putaran ekstensi DNA templat dari primer terikat, fragmen DNA yang
dihasilkan didenaturasi panas dan dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan elektroforesis
gel. Dalam publikasi asli tahun 1977, [2] pembentukan loop berpasangan-dasar ssDNA adalah
penyebab kesulitan serius dalam menyelesaikan band di beberapa lokasi. Ini sering dilakukan
dengan menggunakan gel poliakrilamid-urea denaturasi dengan masing-masing dari empat reaksi
dijalankan di salah satu dari empat jalur individu (jalur A, T, G, C). Pita DNA kemudian dapat
divisualisasikan dengan autoradiografi atau sinar UV dan urutan DNA dapat langsung dibaca
dari film sinar-X atau gambar gel.

Fluorescent ddNTP molecules

Bagian dari gel sekuensing berlabel radioaktif

Pada gambar di atas, film sinar-X terpapar pada gel, dan pita gelap berhubungan dengan
fragmen DNA dengan panjang yang berbeda. Pita hitam di jalur menunjukkan fragmen DNA
yang merupakan hasil pemutusan rantai setelah penggabungan dideoksinukleotida (ddATP,
ddGTP, ddCTP, atau ddTTP). Posisi relatif dari pita yang berbeda di antara empat jalur, dari
bawah ke atas, kemudian digunakan untuk membaca urutan DNA.

Variasi teknis dari urutan pemutusan rantai termasuk penandaan dengan nukleotida yang
mengandung fosfor radioaktif untuk radiolabelling, atau menggunakan primer berlabel pada
ujung 5 'dengan pewarna fluorescent. Pengurutan primer-pewarna memfasilitasi pembacaan
dalam sistem optik untuk analisis dan otomasi yang lebih cepat dan lebih ekonomis.
Pengembangan kemudian oleh Leroy Hood dan rekan kerja [3] [4] dari ddNTP berlabel
fluoresensi dan primer mengatur panggung untuk sekuensing DNA otomatis, throughput tinggi.

Fragmen DNA diberi label dengan tag radioaktif atau fluoresen pada
primer , dalam untai DNA baru dengan dNTP berlabel, atau dengan ddNTP berlabel.
 Metode terminasi rantai sangat menyederhanakan urutan DNA. Misalnya, kit berbasis
pemutusan rantai tersedia secara komersial yang berisi reagen yang diperlukan untuk pengurutan,
pra-aliquoted, dan siap digunakan. Keterbatasan termasuk pengikatan primer non-spesifik
terhadap DNA, yang mempengaruhi pembacaan akurat urutan DNA, dan struktur sekunder DNA
yang mempengaruhi kesetiaan urutan.

Dye-terminator sequencing

Electrophoresis kapiler

Urutan tangga dengan urutan radioaktif dibandingkan dengan puncak

fluorescent
Sekuens terminator pewarna menggunakan pelabelan terminator rantai ddNTP, yang
memungkinkan sekuensing dalam reaksi tunggal, daripada empat reaksi seperti pada metode
primer berlabel. Dalam urutan pewarna-terminator, masing-masing dari empat terminator rantai
dideoksinukleotida diberi label dengan pewarna fluoresen, yang masing-masing memancarkan
cahaya pada panjang gelombang yang berbeda.

Karena kemanfaatan dan kecepatannya yang lebih besar, pengurutan pewarna-terminator

sekarang menjadi andalan dalam pengurutan otomatis. Keterbatasannya termasuk efek pewarna
karena perbedaan dalam penggabungan terminator rantai berlabel pewarna ke dalam fragmen
DNA, menghasilkan ketinggian puncak yang tidak sama dan bentuk dalam kromatogram jejak
urutan DNA elektronik setelah elektroforesis kapiler (lihat gambar di kiri).
Tampilan awal contoh terminator pewarna yang terbaca

Masalah ini telah diatasi dengan penggunaan sistem enzim DNA polimerase yang
dimodifikasi dan pewarna yang meminimalkan variabilitas penggabungan, serta metode untuk
menghilangkan "gumpalan pewarna". Metode sekuensing terminator pewarna, bersama dengan
analisis sekuens DNA throughput tinggi otomatis, digunakan untuk sebagian besar proyek
sekuensing sampai diperkenalkannya Next Generation Sequencing.

Automisasi dan persiapan sampel

Instrumen pengurutan DNA otomatis (sequencer DNA) dapat mengurutkan hingga 384
sampel DNA dalam satu batch. Batch run dapat terjadi hingga 24 kali sehari. Sequencer DNA
memisahkan untaian berdasarkan ukuran (atau panjang) menggunakan elektroforesis kapiler,
mereka mendeteksi dan merekam fluoresensi pewarna, dan menghasilkan data sebagai
kromatogram jejak puncak fluoresen. Reaksi sekuensing (thermocycling dan labeling),
pembersihan dan penskorsan ulang sampel dalam larutan buffer dilakukan secara terpisah,
sebelum memuat sampel ke sequencer. Sejumlah paket perangkat lunak komersial dan non-
komersial dapat memangkas jejak DNA berkualitas rendah secara otomatis. Program-program
ini menilai kualitas setiap puncak dan menghilangkan puncak-puncak dasar berkualitas rendah
(yang umumnya terletak di ujung urutan). Keakuratan algoritma semacam itu lebih rendah
daripada pemeriksaan visual oleh operator manusia, tetapi memadai untuk pemrosesan otomatis
kumpulan data urutan besar.

Tantangan

Tantangan umum dari sekuensing DNA dengan metode Sanger termasuk kualitas yang
buruk pada 15-40 basis pertama dari sekuens karena pengikatan primer dan penurunan kualitas
jejak sekuensing setelah 700-900 basis. Perangkat lunak pemanggil dasar seperti Phred biasanya
memberikan perkiraan kualitas untuk membantu memangkas urutan wilayah berkualitas rendah.

Dalam kasus di mana fragmen DNA diklon sebelum diurutkan, sekuens yang dihasilkan
dapat berisi bagian-bagian dari vektor kloning. Sebaliknya, teknologi kloning berbasis PCR dan
generasi berikutnya berdasarkan pyrosequencing sering menghindari menggunakan vektor
kloning. Baru-baru ini, metode sekuensing satu langkah Sanger (amplifikasi dan sekuensing
gabungan) seperti Ampliseq dan SeqSharp telah dikembangkan yang memungkinkan pengurutan
cepat gen target tanpa kloning atau amplifikasi sebelumnya. [7] [8]

Metode saat ini dapat secara langsung mengurutkan fragmen DNA yang relatif pendek
(panjang 300-1000 nukleotida) dalam satu reaksi. Hambatan utama untuk mengurutkan fragmen
DNA di atas batas ukuran ini adalah kekuatan pemisahan yang tidak memadai untuk
menyelesaikan fragmen DNA besar yang panjangnya berbeda hanya dengan satu nukleotida.
Urutan Sanger Microfluidic

Pengurutan Microfluidic Sanger adalah aplikasi lab-on-a-chip untuk pengurutan DNA, di

mana langkah-langkah pengurutan Sanger (siklus termal, pemurnian sampel, dan elektroforesis
kapiler) diintegrasikan pada chip skala wafer menggunakan volume sampel skala nano.
Teknologi ini menghasilkan urutan yang panjang dan akurat, sementara menghindarkan banyak
kekurangan signifikan dari metode Sanger konvensional (misalnya konsumsi tinggi reagen
mahal, ketergantungan pada peralatan mahal, manipulasi intensif personel, dll.) Dengan
mengintegrasikan dan mengotomatiskan langkah-langkah sekuensing Sanger .

Dalam permulaannya yang modern, sekuensing genom throughput tinggi melibatkan

memecah-mecah genom menjadi potongan-potongan kecil beruntai tunggal, diikuti oleh
amplifikasi fragmen-fragmen tersebut dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Mengadopsi
metode Sanger, setiap fragmen DNA dihentikan secara permanen dengan penggabungan
nukleotida penghentian rantai dideoksi berlabel berfluoresensi, dengan demikian menghasilkan
"tangga" DNA fragmen yang masing-masing panjangnya berbeda satu basis dan masing-masing
memiliki label fluoresen dasar pada pangkalan terminal. Tangga dasar yang diamplifikasi
kemudian dipisahkan oleh Capillary Array Electrophoresis (CAE) dengan deteksi “garis akhir”
in situ yang otomatis dari fragmen ssDNA berlabel fluoresensi, yang menyediakan urutan urutan
fragmen. Urutan ini dibaca kemudian dirakit komputer menjadi urutan yang tumpang tindih atau
berdekatan (disebut "contigs") yang menyerupai urutan genom penuh setelah dirakit sepenuhnya.

Metode Sanger mencapai panjang baca sekitar 800bp (biasanya 500-600bp dengan DNA
yang tidak diperkaya). Panjang baca yang lebih lama dalam metode Sanger menampilkan
keuntungan yang signifikan dibandingkan metode sekuensing lainnya terutama dalam hal
pengurutan daerah berulang genom. Suatu tantangan dari data sekuens yang membaca singkat
adalah suatu masalah dalam sekuensing genom baru (de novo) dan dalam sekuensing segmen
genom yang sangat tersusun ulang, biasanya yang terlihat dari genom kanker atau di daerah
kromosom yang menunjukkan variasi struktural.

Aplikasi teknologi pengurutan mikrofluida

Aplikasi lain yang berguna dari sekuensing DNA termasuk deteksi nukleotida
polimorfisme (SNP) tunggal, polimorfisme konformasi untai tunggal (SSCP) analisis
heterodupleks, dan analisis pengulangan tandem pendek (STR). Menyelesaikan fragmen DNA
berdasarkan perbedaan ukuran dan / atau konformasi adalah langkah paling kritis dalam
mempelajari fitur-fitur genom ini. [9]

Desain perangkat

Chip sequencing memiliki konstruksi empat lapis, yang terdiri dari tiga wafer kaca
berdiameter 100 mm (di mana elemen perangkat dibuat mikro) dan membran
polydimethylsiloxane (PDMS). Ruang reaksi dan saluran elektroforesis kapiler terukir di antara
dua wafer kaca teratas, yang terikat secara termal. Interkoneksi saluran tiga dimensi dan
microvalves dibentuk oleh PDMS dan wafer kaca berjenis bawah.

Perangkat ini terdiri dari tiga unit fungsional, masing-masing sesuai dengan langkah-
langkah urutan Sanger. Unit Thermal Cycling (TC) adalah ruang reaksi 250 nanoliter dengan
detektor suhu resistif terintegrasi, microvalves, dan pemanas permukaan. Pergerakan reagen
antara lapisan semua-kaca atas dan lapisan kaca-PDMS yang lebih rendah terjadi melalui lubang-
lubang berdiameter 500 μm. Setelah siklus termal, campuran reaksi mengalami pemurnian di
ruang penangkap / pemurnian, dan kemudian disuntikkan ke dalam ruang elektroforesis kapiler
(CE). Unit CE terdiri dari kapiler 30 cm yang dilipat menjadi pola switchback kompak melalui
belokan selebar 65 μm.

Dalam ruang reaksi TC, reagen sekuensing terminator pewarna, DNA templat, dan
primer dimasukkan ke dalam ruang TC dan didaur-termal selama 35 siklus (pada 95 ° C selama
12 detik dan pada 60 ° C selama 55 detik).

Pemurnian

Campuran reaksi yang diisi (mengandung fragmen ekstensi, DNA templat, dan reagen
sekuensing berlebih) dilakukan melalui ruang penangkapan / pemurnian pada suhu 30 ° C
melalui medan listrik 33-Volts / cm yang diterapkan antara outlet keluar dan port inlet. Gel
penangkap melalui mana sampel digerakkan, terdiri dari 40 μM oligonukleotida (komplementer
dengan primer) terikat secara kovalen ke matriks poliakrilamida. Fragmen ekstensi diimobilisasi
oleh matriks gel, dan kelebihan primer, templat, nukleotida bebas, dan garam dielusi melalui port
limbah tangkap. Gel tangkap dipanaskan hingga 67-75 ° C untuk melepaskan fragmen ekstensi.

Elektroforesis kapiler

Fragmen ekstensi disuntikkan ke dalam ruang CE di mana mereka dielektroforesis

melalui bidang 125-167-V / cm.

Platform

Platform Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Dublin, CA) [11]

mengintegrasikan dua langkah sekuensing Sanger pertama (bersepeda termal dan pemurnian)
dalam sistem yang sepenuhnya otomatis. Pabrikan mengklaim bahwa sampel siap untuk
elektroforesis kapiler dalam waktu tiga jam dari sampel dan reagen dimasukkan ke dalam sistem.
Platform Apollo 100 membutuhkan volume reagen sub-mikroliter.

Perbandingan beberapa teknik sequencing

Nilai kinerja untuk teknologi sekuensing genom termasuk metode Sanger dan metode generasi
berikutnya
 Teknologi Jumlah Volum Waktu Panjang Hasil ( Gel Jalur
Jalur injeksi analisis rata-rata termasuk lacak
(nL) analisis )
Slab gel 96 500- 6-8 jam 700 bp 0.0672 Ya Ya
1000
Capillary 96 1-5 1-3 jam 700 bp 0,166 Tidak Tidak
array
elektroforesis
Microchip 96 0,1-0,5 6-30 430 bp 0,660 Tidak Tidak
menit
454/Roche < 0,001 4 jam 200-300 20-30 Tidak
FLX (2008) bp
Illumina/Sole 2-3 hari 30-100 20 Tidak
xa (2008) bp
ABI/SOLID 8 hari 35 bp 5-15 Tidak
(2008)
Illumina 1-3 hari 2x75- 170-250 Tidak
MISeq 2x300
(2019) bp
Illumina 1-2 hari 2x50- 22.000- Tidak
NovaSeq 2x150 67000
(2019) bp
Ion torren ion 2,5-4 200-600 110-920 Tidak
530 (2019) jam bp
BGI 1 hari 2x150 250.000 Tidak
MGISEQ-T7 bp
(2019)
Pasific 10-20 10-30 1.300 Tidak
Biosciences jam kb
(2019)
Oxford 3 hari 13-20 700 Tidak
Nanopore kb
Minion
(2019)

Tujuan akhir dari sekuensing throughput tinggi adalah untuk mengembangkan sistem
yang berbiaya rendah, dan sangat efisien untuk mendapatkan panjang bacaan yang lebih panjang
(lebih lama). Panjang baca yang lebih panjang dari setiap pemisahan elektroforesis tunggal,
secara substansial mengurangi biaya yang terkait dengan pengurutan DNA de novo dan jumlah
templat yang diperlukan untuk mengurutkan DNA yang terkandung pada redundansi yang
diberikan. Microfluidics memungkinkan perakitan urutan yang lebih cepat, lebih murah dan
lebih mudah.