LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

PERCOBAAN 5 : FLOWCYTOMETRY

Dosen Pengampu : Drs. Apt.,H.Ibrahim Arifin, M.Sc

Hari/Tanggal Praktikum : Kamis, 10 Juni 2021

Disusun oleh :

Nama : Yuniar Akhidatul M

NIM : 19105011040
Kelas/ Gol : A/ II E

LABORATORIUM KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS WAHID HASYIM

SEMARANG

JUNI 2021
 LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

PERCOBAAN 5 : FLOWCYTOMETRY

I. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa mampu mengetahui prinsip kerja dari flowcytometry.
2. Mahasiswa mampu mengetahui pengaruh ekstrak metanol daun kenikir dan
doksorubisin terhadap sel kanker payudara.

II. DASAR TEORI

Flow cytometry merupakan suatu teknik yang dapat digunakan untuk
menganalisis jenis-jenis sel yang terdapat pada suatu populasi sel yang heterogen secara
akurat dan cepat. Flow cytometry dapat digunakan untuk membedakan sel atau partikel
berdasarkan penyebaran sinar serta untuk menghitung persentase subpopulasi sel.
Prinsip kerja dari flow cytometry adalah memanfaatkan penyebaran sinar dari sel yang
dialirkan satu persatu melalui sinar laser. Sel tersebut kemudian diamplifikasi dan
dikonversi menjadi sinyal digital. Hasilnya tertera pada layar monitor berupa
scattergram dan two parameter dot plots. Selain itu, dapat juga dilakukan analisis
menggunakan teknik fluoresensi yang dihasilkan dari sel yang dilabeli dengan
fluorescence, yaitu sel terlebih dahulu diberi pewarna/fluorescence, sehingga hasil yang
muncul pada layar monitor adalah berupa scattergram yang berwarna sesuai dengan
pewarna/fluorescence yang dilabeli ke sel tersebut. Keuntungan dari flow cytometry
yaitu memiliki tingkat efisiensi dan sensitivitas yang tinggi terhadap sel. (Nadhira M,
dkk., 2018)
Flow cytometry merupakan suatu pemeriksaan laboratorium yang dilakukan
untuk mendeteksi, menentukan, dan menghitung sel apapun, seperti sel darah atau
sumsum tulang belakang secara spesifik. Metode pemeriksaan ini membantu dokter
dalam melakukan klasifikasi jenis sel sehingga rencana pengobatan untuk penyakit
pasien dapat ditentukan Pemeriksaan yang menggunakan alat khusus bernama flow
cytometer ini akan mengukur jumlah, persentase, dan karakteristik seperti ukuran,
 bentuk, dan ada atau tidaknya penanda sel bernama biomarker pada permukaan
sel. Flow cytometry biasanya dilakukan untuk mendiagnosis kanker dan memeriksa
kondisi kesehatan setelah transplantasi organ. Terdapat dua jenis kit flow cytometry,
yaitu multicolor dan singlecolor. flow cytometry multicolor digunakan untuk
mengidentifikasi MSC, yang menunjukkan presentase heterogenitas sel dalam populasi
dengan berbagai ekspresi penanda khusus MSC. Sedangkan flow cytometry single
color hanya dapat menunjukkan presentase sel yang diekspresikan pada setiap penanda
MSC secara individu (Khalisha A, dkk., 2018)
Salah satu hal mendasar pada prinsip kerja flowcytometry adalah kemampuan
untuk memeriksa partikel atau sel tunggal. Ketika cairan sampel diinjeksi melalui
flowcytometry, partikel akan tersebar acak pada ruangan 3 dimensi. Sampel harus
berada dalam aliran yang hanya mengandung paartikel tunggal sehingga dapat
diperiksa oleh system deteksi mesin. Proses ini diatur oleh system fluiditas. System
fluiditas terdiri dari saluran pusat (central channel/core) dimana sampel diinjeksikan,
dan diselubungi oleh membrane luar yang terdiri dari cairan dengan aliran yang deras.
Ketika cairan membrane mengalir akan menghasilkan efek tarikan massif pada ruang
tegah yang sempit. Hai ini akan merubah kecepatan aliran tengah dimana aliran
depannya akan membentuk setengah lingkaran dengan kecepatan terbesar di tengah
dan kecepatan nol pada dinding. Efek ini manghasilkan deretan tunggal partikel yang
disebut focus hidrodinamik (Rahman, 2006).
III. ALAT DAN BAHAN
Alat :
• Seperangkat alat gelas
• Sentrifuge
• Rotary evaporator
• Corong pisah
• Mikroskop fluoresens
• Mikroskop cahaya
• Mikropipet
• Vortex
• Seperangkat alat flowcytometry
 Bahan :
• Daun kenikir (Cosmos caudatus Kunth.)
• Metanol
• Kultur sel kanker payudara T47D
• Media yang mengandung RPMI 1640
• Media penumbuh yang mengandung FBS (Fetal Bovine Serum) 10%
• Penisilin-streptomisin 10%
• DMSO
• Ekstrak metanol daun kenikir
• Doksorubisin
• Aquadest
• Reagen MTT
• Reagen stopper berupa SDS 10% dalam HCl 0,01N
• Senyawa glikosida kuersetin

IV. CARA KERJA

Kultur sel T47D yang telah konfluen dipanen dan didistribusikan dengan konsentrasi
5 x 105 sel per sumuran dalam 2000 µL media RPMI ke dalam plate 6 well
↓
Diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2
↓
Dibuang media RPMI dengan cara disedot dengan hati-hati dan dicuci sel dengan
FBS
↓
Ditreatment sampel terhadap sel T47D dengan perlakuan kontrol sel T47D dan
sampel ekstrak dan fraksi metanol daun kenikir yang aktif memiliki potensi sitotoksik
terhadap cell line kanker payudara T47D dengan menggunakan konsentrasi IC50-nya
↓
Diinkubasi kembali selama 24 jam ke dalam inkubator CO2

Preparasi sampel untuk flowcytometry :

Diambil media dalam well kemudian ditampung dalam masing-masing conical
↓
 Ditambahkan 250 µl tripsin
↓
Diinkubasi selama 3 menit
↓
Dipastikan sel sudah lepas satu per satu
↓
Diambil sel kemudian ditampung dalam conical lalu ditambah 2 ml FBS
↓
Disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit
↓
Dibuang supernatan
↓
Untuk perlakuan apoptosis ditambah 1 ml FBS kemudian diresuspensi dan dipindah
ke dalam eppendorf
↓
Untuk perlakuan siklus sel ditambah 1 ml etanol dingin kemudian diresuspensi dan
dipindah ke dalam eppendorf
↓
Masing-masing eppendorf diinkubasi selama 30 menit dalam lemari es
↓
Untuk perlakuan apoptosis, masing-masing eppendorf disentrifuse pada 2000 rpm
selama 3 menit maka sel siap untuk diuji dengan flowcytometer

Pengujian dengan flowcytometry :

Media pada tabung eppendorf dibuang
↓
Dimasukkan 100 µl reagen Annexin V-PI ke dalam tabung eppendorf dan buffer
sebanyak 350 µl
↓
Divortex, kemudian diinkubasi pada suhu ruang dan tempat gelap selama 10 menit
↓
Suspensi sel tersebut dipindahkan ke flowcytotube, maka suspensi sel siap untuk
diinjeksikan pada alat flowcytometry
↓
 Reagen flowcytometry sebanyak 400 µl pada tiap eppendorf diresuspen dengan
homogen
↓
Tiap eppendorf dibungkus dengan alumunium foil dan diberi penandaan pada bagian
atas eppendorf
↓
Semua eppendorf diinkubasi di waterbath 37oC selama 10 menit untuk mengaktivasi
RNase
↓
Diresuspen kembali sebelum ditransfer ke flowcytotube
↓
Suspensi sel ditransfer ke dalam flowcytotube melalui filter (kain nylon/kain kaca)
menggunakan mikropipet 1 ml
↓
Dlubangi tutup flowcytotube terlebih dahulu
↓
Dibaca dengan flowcytometer FACS Calibur untuk mengetahui profil cell cycle
↓
Data flowcytometry dianalisis dengan menggunakan program cell quest untuk melihat
distribusi sel pada fase-fase daur sel sub G1, S, G2/M dan sel yang mengalami
poliploidi
↓
Flowcytometry dilakukan dengan pancaran cahaya 488 nm dan dengan kecepatan
medium (500 sel/detik).

V. PEMBAHASAN
Kanker payudara adalah pertumbuhan sel yang abnormal pada jaringan
payudara seseorang. Payudara wanita terdiri dari lobulus (kelenjar susu), duktus
(saluran susu), lemak dan jaringan ikat, pembuluh darah dan limfe. Sebagian besar
kanker payudara bermula pada sel-sel yang melapisi duktus (kanker duktal), beberapa
bermula di lobulus (kanker lobular), serta sebagian kecil bermula di jaringan lain.
Pilihan utama terapi kanker payudara dilakukan dengan menggunakan agen
kemoterapi, salah satu diantaranya yang dikenal paling luas adalah doksorubisin.
Penggunaan doksorubisin dosis tinggi berisiko menimbulkan kardiotoksisitas yang
dapat menyebabkan kematian. Selain itu, penggunaan doksorubisin dapat
meningkatkan terjadinya multi drug resistance (MDR). Pengatasan efek samping
doksorubisin dilakukan melalui melalui pendekatan penggunaan kombinasi kemoterapi
(kokemoterapi). Salah satu bahan alam atau herbal yang berpotensi untuk
dikembangkan sebagai agen kokemoterapi adalah ekstrak metanol daun kenikir
(Cosmos caudatus, Kunth.). Ekstrak metanol daun kenikir memiliki aktivitas memacu
kematian sel T47D melalui mekanisme apoptosis, sehingga berpotensi untuk
dikembangkan sebagai obat antikanker. Kandungan flavonoid glikosida kuersetin
dalam ekstrak metanol daun kenikir dilaporkan memiliki efek sitotoksik terhadap sel
kanker payudara T47D dengan IC50 344,91 μg/mL. (Zulkarnain, 2004)
Flow cytometry adalah teknologi yang menyediakan analisis multi-parametrik
cepat dari sel tunggal dalam larutan. Flow cytometers memanfaatkan laser sebagai
sumber cahaya untuk menghasilkan sinyal cahaya yang tersebar dan berpendar yang
dibaca oleh detektor seperti fotodioda atau tabung pengganda foto. Sinyal ini diubah
menjadi sinyal elektronik yang dianalisis oleh komputer dan ditulis ke file data format
standar (.fcs). Populasi sel dapat dianalisis dan/atau dimurnikan berdasarkan
karakteristik fluoresen atau hamburan cahayanya. Berbagai reagen fluoresen digunakan
dalam flow cytometry. Ini termasuk, antibodi terkonjugasi fluoresensi, pewarna
pengikat DNA, pewarna viabilitas, pewarna indikator ion dan protein ekspresi
fluoresen. Flowcytometry dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui
pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-diamino2-
phenylindole (DAPI). Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan
berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propium iodide maka tiap sel yang
memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi
yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin
besar. Alat yang digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel pada
penelitian ini adalah FACS atau flowcytometer (Teguh T dan Mulyono B., 2003)
Praktikum kali ini di lakukan penelitian flowcytometer dengan tujuan
praktikum Mahasiswa mampu mengetahui prinsip kerja dari flowcytometry dan
Mahasiswa mampu mengetahui pengaruh ekstrak metanol daun kenikir dan
doksorubisin terhadap sel kanker payudara. Alat yang di gunakan antara lain yaitu
Seperangkat alat gelas, Sentrifuge, Rotary evaporator, Corong pisah, Mikroskop
fluoresens, Mikroskop cahaya, Mikropipet, Vortex, Seperangkat alat flowcytometry.
Sedangkan bahan-bahan yang di gunaakan adalah Daun kenikir (Cosmos caudatus
 Kunth.), Metanol, Kultur sel kanker payudara T47D, Media yang mengandung RPMI
1640, Media penumbuh yang mengandung FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-
streptomisin 10%, DMSO, Ekstrak metanol daun kenikir, Doksorubisin, Aquadest,
Reagen MTT, Reagen stopper berupa SDS 10% dalam HCl 0,01N dan Senyawa
glikosida kuersetin. Berdasarkan penelitian ,diperoleh hasil bahwa kombinasi estrak
metanool daun kenikir dan doksorubisin memiliki kemampuan yang besar dalam
menekan viabilitas kanker payudara T47D .pada proses modulasi siklus sel, ekstrak
methanol daun kenikir dan doksorubisin dapat menyebabkan akumulasi sel pada fase
G2/M.sedangkan pada induksi apopotosis,ekstrak matanol daun kenikir dan
doksorubisin mampu menginduksi apoptosis sehingga ekstrak methanol daun kenikir
memiliki hubungan yang sinergis terhadap sel kanker payudara T47D. el T47D
merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara
seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering dipakai dalam penelitian
kanker secara in vitro karena mudah penangannya, memiliki kemampuan replikasi yang
tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock jika
terjadi kontaminasi. Sel T47D memiliki morfologi seperti sel epitel. Sel ini dikulturkan
dalam media DMEM + 10 % FBS + 2 mM L-Glutamin, diinkubasi dalam CO2
inkubator 5 % dan suhu 37oC.

VI. KESIMPULAN
Kombinasi ekstrak metanol daun kenikir dan doksorubisin memiliki
kemampuan yang besar dalam menekan viabilitas sel kanker payudara T47D sehingga
ekstrak metanol daun kenikir memiliki hubungan yang sinergis terhadap sel kanker
payudara T47D. Flow cytometry merupakan suatu pemeriksaan laboratorium yang
dilakukan untuk mendeteksi, menentukan, dan menghitung sel apapun, seperti sel darah
atau sumsum tulang belakang secara spesifik. Prinsip kerja flowcytometry adalah setiap
sel akan dialirkan dalam sistem fluida, lalu ditembak dengan sinar laser, kemudian
disebarkan oleh setiap sel. Selain itu, sinar laser tersebut juga dapat mengaktivasi
senyawa fluoresen yang terdapat dalam sel
 Daftar Pustaka

Arifin, Ibrahim. 2021. Aplikasi Flowcytometry pada Analisis Kanker Tertarget Cell
Cycle dan Apoptosis. Universitas Wahid Hasyim Semarang
Khalisha A, dkk., vol. 4 no. 4 tahun 2018, Profil Mesenchymal Stem Cell (MSC)
Pasien Klinik Hayandra Pada Media Kultur Bersuplemen Menggunakan Flow
Cytometry, Jakarta, Universitas Al Azhar Indonesia Fakultas Sains dan
Teknologi
Nadhira M, dkk., vol. 4 no. 4 tahun 2018, Profil Peripheral Blood Mononuclear Cells
(PBMC) Pasien dengan Berbagai Usia Menggunakan Flow Cytometry di
Klinik Hayandra, Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Tekhnologi,
Jakarta, Universitas Al-Azhar Indonesia Fakultas Sains dan Teknologi
Rahman, Misha. 2006. Introduction to Flow Cytometry. AbD Serotec
Teguh T dan Mulyono B , no. 2 tahun 2003, Aplikasi Flow Cytometry di
Laboratorium, Berkala Kesehatan Klinik, pp. 115-125
Zulkarnain, vol. 4 no. 2 tahun 2004, Analisis Ploidi Secara Konvesional dan Metoda
FlowCytrometri, Jurnal Ilmiah, Jambi, Universitas Batanghari