Fraksionasi Seluler

Latar Belakang Informasi

Setiap organel memiliki sifat/karakteristik (contoh: ukuran, bentuk, dan kepadatan), yang
membuat satu organel berbeda dengan organel yang lain di dalam sel. Jika sel
“dibuka/dipecahkan”, maka setiap organel-organelnya dapat diisolasi. Suatu proses
memecahkan sel pada suatu larutan penyangga isotonik disebut homogenisasi dan
langkah selanjutnya untuk mengisolasi organel disebut fraksionasi seluler. Proses isolasi
organel membutuhkan pengetahuan tentang teknik kimia fisika, dan beberapa teknik
tersebut mempunyai kisaran dari penyaringan sederhana, sedimentasi gravitasi atau
preseipitasi diferensial, sampai ultrasentrifugasi organel-organel yang telah ditandai
secara fluoresen pada gradien kepadatan yang dihasilkan oleh pemrograman komputer.
Pada percobaan ini, fraksionasi seluler dari hati ayam/tikus yang telah dihomogenisasi
akan dilakukan dengan menggunakan teknik yang disebut sentrifugasi diferensial, yang
bergantung pada pinsip bahwa selama komponen seluler tersebut lebih padat daripada
medium disekelilingnya, partikel yang memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda akan
bergerak ke arah dasar dari tabung snetrifugasi pada laju yang berbeda. Partikel yang
memiliki kepadatan yang lebih tinggi akan membentuk sedimen pada kecepatan yang
lebih tinggi daripada partikel yang kepadatannya lebih rendah.
Tahap awal dari sentrifugasi diferensial pada umumnya tidak menghasilkan hasil yang
murni, sehingga dibutuhkan tahap berikutnya. Pada beberapa kasus, tahap purifiksasi
selanjutnya dari ekstrak kasar dilakukan melalui gradien densiti sukrosa.
Terdapat dua tipe sentrifuga berdasarkan rotornya. Model swinging-bucket: rotor akan
membuat tabung terayun, yang menyebabkan partikel bergerak paralel ke arah dinding
tabung. Model fixed-angle: tabung sentrifuga dipertahankan pada sudut tertentu sehingga
partiel tidak akan bergerak ke dasar tetapi ke dinding tabung.

Relative centrifugal force (RCF) is defined as the ratio of the centrifugal force to the
force of gravity, or RCF = Fc/Fg = ω2r/980a
π (expressed in radians/second) is converted to revolutions per minute (rpm) by
substituting ω = π (rpm) / 30, resulting in; RCF = 1.119 x 10-5 (rpm)2r
where r is expressed in cm. RCF units are expressed as “g”.

Microscopic Examination Of Nuclear Fraction

The nuclear fraction that has been isolated in the previous experiment (Tube N) will be
examined microscopically to identify the nuclei, in addition approximate size of the
nuclei will be measured (refer to Experiment #1).
The nucleus is separated from the cytoplasm by an envelope consisting of two
membranes. The entire chromosomal DNA is held in the nucleus; packaged into
chromatin fibers by its association with an equal mass of histone proteins. The nuclear
contents communicate with the cytosol by means of openings in the nuclear envelope
called nuclear pores. Nucleoli are large, round or oval structures, in which ribosomal
subunits are assembled, thus are rich in RNA and protein.
2627
For the observations on nuclei, the stain to be used is aceto-orcein, which stains
chromatin red. The nucleoli stand out since they do not stain with the orcein. Each
nucleolus appears as a prominent, round, clear area.

Bahan
Hati ayam/sapi
0,25 M sukrosa 50 ml
Sentrifuga
Homogenizer
Mikropipet dan tips
Vortex
Ice bucket

Tata kerja
1. Iris-iris hati sebesar kurang lebih beberapa mm3
2. Tambahkan 0,25 M sukrosa (10% w/v)
3. Homogenisasi dengan menggunakan syringe?
4. Sentrifugasi homogenat untuk membuang debris sel pada kecepatan 800 g selama 5
menit.
5. Ambil supernatan: ini adalah homogenat keseluruhan.
6. Sentrifugasi homogenat yang ada selama 15 menit pada kecepatan 5000g.
7. Buang supernatan
8. Apus sejumlah kecil pelet pada kaca objek yang bersih dengan spatula.
9. Segera sebelum apusan kering, tambahkan beberapa tetes pewarna lacto-aceto-orcein.
10. Setelah beberapa detik, letakan kaca penutup di atasnya dan tekan sedikit untuk
mengeluarkan sisa pewarna dengan menggunakan kertas tissue dengan hati-hati.
11. Amati sediaan di atas dengan menggunakan miksoskop cahaya dengan objektif
sedang. Setelah lensa telah difokuskan pada bagian pelet, kemudian ganti objektif yang
lebih tinggi.
12. Draw a typical nucleus, labeling nucleolus and estimate the nuclear diameter

QUESTIONS:
1. Why was “liver” chosen as the target organ for cellular fractionation? 2. Why was
homogenization and subsequent suspension of organelles done in 0.25M
sucrose solution? 3. Why were all steps carried out in relatively lower temperatures
(centrifuges were fixed
to 4oC and organelles were stored at -70oC)? 4. Please calculate the radius for centrifuge
#1 using the given “g value” in the manual
and the “rpm value” read from the centrifuge. 5. Please calculate the “rpm values” for
centrifuge #2 using the given “g and r values”
given in the manual. 6. Why do you think that the organelles obtained with this method
are not absolutely
pure? Can you suggest an additional or alternative method to better purify these
organelles?

Glass will absorb radiation below 320nm whereas quartz will allow transmission of the UV
wavelengths.

So use glass cuvettes for wavelengths in the visible range from 380nm to 780nm and quartz cuvettes
for wavelengths below 380nm.

Read more:
http://wiki.answers.com/Q/Why_do_you_use_quartz_cuvette_rather_than_using_glass_cuvettes#ixzz2
3CgahHlw

Tugas 3. Analisis kariotipe dan indeks mitosis (Nilai 10)

Persyaratan:

Pada tugas ini, anda diminta untuk menunjukkan analisis kariotipe pada
tumbuhan. Anda memerlukan mikroskop untuk mengamati sel-sel pada jaringan
meristem akar dan mendapatkan sel yang mengalami pembelahan mitosis.

Bahan dan Alat

(1) Potongan akar (panjang kira-kira 5-10 mm) pada tabung sentrifugasi.
(2) Sebuah mikroskop dengan lensa objektif 10x, 20x, 40x.
(3) Larutan karbol fusin (sebagai pewarna). (dalam tabung sentrifugasi yang
ditandai CF)
(4) Pinset, silet, rak tabung, kaca objek, kaca penutup objek, dan kertas saring.
(5) Sebuah tabung sentrifugasi berukuran 1,5 ml yang mengandung ± 1 ml
larutan 1 N HCl.

Penting:

Anda akan menggunakan larutan 1 N HCl untuk perlakuan potongan akar.

Larutan HCl sangat berbahaya terhadap mata dan kulit anda. Gunakan sarung
tangan jika anda bekerja dengan larutan tersebut. Jika anda terkena larutan HCl
pada bagian tubuh anda, laporkan segera pada instruktur atau pengawas di
ruang tes.

Cara kerja:

Anda akan mendapatkan tiga akar tumbuhan. Ikuti cara kerja di bawah ini,
sehingga anda dapat mengamati kromosom dari sel-sel yang mengalami mitosis.

(1) Gunakan pinset untuk mengambil potongan akar dan masukan ke dalam
botol kecil yang mengandung larutan 1 N HCl.

(2) Letakan botol tersebut ke dalam waterbath yang sudah di atur pada suhu
60°C selama 8 menit. Waterbath terletak di meja instruktur.

(3) Dengan hati-hati ambil potongan akar dari larutan HCl dengan pinset dan
letakan ke dalam glas baker (piala) yang mengandung aquades. Dengan hati-
hati, kocoklah selama 1 menit.
(4) Ambil potongan akar dari aquades. Penting, sekarang potongan akar mudah
hancur. Dianjurkan gunakan pinset untuk mengambil akar dan jangan
disentuh !!!
(5) Letakan potongan akar pada kaca objek. Kemudian potong jaringan akar
 pada bagian yang kaya dengan sel-sel, yaitu daerah 1 mm dari bagian atas
akar. Buang bagian potongan yang lain.
(6) Ambil 1 tetes larutan Carbol Fuchsin dan teteskan pada jaringan akar yang
anda kerjakan sebelumnya dan diamkan selama 7 menit. Geruslah jaringan
tersebut dengan pinset.
(7) Tutuplah degan kaca penutup objek, tekan kaca pentup dengan hati-hati
menggunakan pensil atau pinset sampai jaringan terpisah secara menyeluruh.
(8) Letakan kaca objek tersebut di antara dua kertas saring dan letakkan pada
permukaan yang rata. Dengan hati-hati tekan bagian atas kertas saring pada
jaringan yang telah digerus tadi. Pada waktu yang sama kelebihan larutan
pewarna juga akan terserap oleh kertas saring.
(9) Amati preparat anda di bawah mikroskop.

Catatan:

Anda disediakan tiga potongan akar, untuk menyiapkan spesimen anda. Jika
anda gagal membuat spesimen yang baik untuk pengamatan, silahkan
mengulang cara kerja yang sama dengan akar yang masih ada. Akan tetapi waktu
percobaan anda terbatas !!!

Jawab pertanyaan berikut:

23. Berapa pasangan kromosom pada sel-sel (keadaan metafase) pada

tumbuhan? (nilai 6)

A. 3
B. 4
C. 5
D. 6
E. 7
F. 8
G. 9

24. Jika anda mendapatkan sel-sel pada metafase yang mempunyai jumlah
kromosom yang berbeda, bagaimana anda dapat secara tepat menghitung
jumlah kromosomnya ? ( Nilai 2 )
A. Menghitung jumlah kromosom dari beberapa sel yang berbeda dan
membuat rata-ratanya.
B. Menghitung jumlah kromosom dari beberapa sel; jumlah maksimum
kromosom yang ada merupakan jumlah kromosom yang ada pada
tumbuhan.
C. Menghitung jumlah kromosom pada beberapa sel yang mengalami
metafase; kromosom dari tumbuhan adalah jumlah frekwensi tertinggi.