FLOWCHART

PERCOBAAN 4
ELEKTROFORESIS PROTEIN ENZIM

A. Pemisahan sel-sel darah dan plasma darah

Ambil 5 ml sampel darah, dimasukkan dalam tabung sentrifugasi 10 ml
Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm
Diambil 500 l supernatan, simpan dalam tabung mikrosentrifuse 2 ml (tandai dengan
kode PD)
Buat 2 ulangan tabung mikrosentrifuse 2 ml (tandai dengan kode PD)
Sisa supernatan dibuang dan ditambahkan 6 ml buffer cuci, ditutup rapat
Vorteks
Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm
Buang supernatan dengan menggunakan pipet
Dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali
Endapan yang diperoleh merupakan sel-sel darah

B. Isolasi protein dari sel-sel darah

Ditambahkan 6 ml buffer hemolisis pada endapan sel-sel darah
Tutup tabung dan vorteks
Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm
Diambil 1 ml supernatan dan disimpan dalam tabung mikrosentrifuse 2 ml
Tandai tabung dengan nama Protein Sitoplasmik (PS) simpan dalam lemari es
Sisa supernatan pada tabung dibuang kira-kira 5 ml, kemudian ditambahkan 7 ml
buffer hemolisis dingin dan vorteks kuat

Lakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Buang supernatan dan sisakan 2 ml endapannya, kemudian dipindahkan pada tabung
mikrosentrifugasi 2 ml
Tandai tabung dengan kode Protein Membran (PM)
Lakukan sentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 14.000 rpm
Buang supernatan dan simpan tabung dalam lemari es

C. Pengendapan protein plasma dengan kadar garam tinggi

Ambil tabung mikrosentrifuse 2 ml dan tambahkan 250 l larutan (NH4)2SO4 yang
jenuh
Ditambahkan 500 l sampel plasma (PD)
Tutup tabung dan vorteks secara kuat
Diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan tinggi 14.000 rpm selama 3 menit pada suhu dingin
Diambil bagian supernatan dan simpan dalam tabung sentrifus
Tandai tabung dengan kode PSG dan simpan dalam suhu dingin
Ditambahkan kembali 1 ml larutan 50 % (NH4)2SO4 yang tak jenuh, campurkan
menggunakan pipet tetes
Disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit
Dibuang bagian supernatan dan keringkan endapan
Bagian endapan merupakan sampel protein hasil pengendapan dengan garam
berkonsentrasi tinggi diberi kode PEG

D. Pengendapan protein plasma dengan etanol

Diambil tabung mikrosentrifuse 2 ml dan ditambahkan 250 l (NH4)2SO4 yang jenuh
Ditambahkan 500 l sampel plasma dari tabung dengan kode PD
Tutup tabung dan vorteks secara kuat
Inkubasi pada suhu dingin selama 5 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan tinggi 14.000 rpm selama 3 menit pada suhu dingin
Diambil bagian supernatan dan simpan dalam tabung sentrifus
Tandai tabung dengan kode PSE dan simpan dalam suhu dingin
Ditambahkan kembali 1 ml etanol dalam kondisi dingin dan campurkan menggunakan
pipet tetes
Disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit
Dibuang bagian supernatan dan keringkan endapan
Bagian endapan merupakan sampel protein hasil pengendapan dengan etanol diberi
kode PEE

E. Elektroforesis SDS-PAGE
Dibersihkan plat kaca dengan aquades dan etanol (70 %)
Setting kaca dan spacer seperti manual vertical elektroforesis yang tersedia
Disiapkan SDS-PAGE linear slab gel dengan konsentrasi stracking gel (3 %) dan
resolving/separating gel (12,5%) dengan mengikuti tabel berikut:

Komponen
Acry-Bisacr (30-0,8%)
Tris H,Cl 1 M (pH 6,8 )
Tris H,Cl 1 M (pH 8,8 )
10 SDS (segar)
10 SDS (segar)
TEMED
Aquades

Stacking gel
3%
450 l
380 l
30 l
30 l
5 l
2,11 l

Revolving gel
12,5 %
3,125 ml
2,75 ml
75 l
75 l
6,25 l
1,505 l

Catatan :
Gunakan sarung tangan dan hati-hati dengan akrilamide
Jangan menambah amonium pesulfat serta TEMED sebelum siap menuangkan campuran
akrilamide kedalam plat kaca yang telah disiapkan sebagai bahan. Bahan tersebut berfungsi
sebagai katalitis polimerase akrilamide.

Dituangkan separating gel dan sisakan kira-kira 3 cm dari sisi plat berkaca bagian atas.

Setelah terjadi polimerisasi separating sel, tuangkan keatasnya stracking gel dan pasang sisir
plastik pada stracking gel sebagai pembentuk sumur sampel.

Setelah gel mengeras lepaskan sisir

Disiapkan sampel protein yang akan dimasukkan kedalam sumur dengan cara sbb:
a. Untuk sampel dengan kode PS, PSG, dan PSE ambil masing masing-masing sampel
sebanyak 50 l, kemudian tambahkan 450 l buffer sampel dan 25 l merkatoetanol kesetiap tabung tersebut.
b. Untuk sampel dengan kode PM, PEG, dan PEE ambil masing-masing sampel
sebanyak 50 l , kemudian tambahkan 900 l buffer sampel dan 25 l merkatoetanol kesetiap tabung tersebut.
c. Tutup tabung microsentrifuse dan vorteks
d. Masukkan kedalam waterbath dalam kondisi mendidih selama 5 menit
e. Sentrifuse dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit

Sampel dimasukkan pada sumur yang telah terbentuk

Elektroforesis dijalankan pada voltage 120 mV selama 3 jam, diikuti pewarnaan gel
menggunakan coomassie blue

Gel direndam dalam larutan staining (destraining 150 ml, coomassie blue 0,2 gr) selama 24
jam (digoyang pelan, kemudian dicuci dengan larutan destaining (50 % Methanol, 10% asam
asetat glasial, 40% H20) beberapa kali dengan digoyang pelan hingga warna biru hilang.

Pita yang terbentuk pada profil protein dianalisis secara kuantitatif dengan metode
pengklusteran. Data profil protein masing-masing strain dikonversikan menjadi + dan
berdasarkan ada tidaknya pita pada posisi disepanjang aliran protein.

Data tersebut kemudian disajika dalam bentuk matriks n x t (n = jumlah tipe pita, t = jumlah
isolat atau strain acuan yang dianalisa). Data ini yang kemudian dianalisa menggunakan
program MVSP versi 3,1 (Kovach 1990) untuk menentukan similaritas diantara isolat-isolat
dengan mengunakan koefisien SSM (Simpe Matching Coeficient) dan algoritma UPGMA (
Unweigthed Pair Group Method wih Aritmatic Averages) (Sneath & Sokai, 1973) dan
hasilnya disajikan dalam betuk dendogram.