TUGAS MATA KULIAH BAKTERIOLOGI PRAKTEK

(Pseudomonas sp.)

Pra – Analitik
1. Pembuatan media BA

 ALAT DAN BAHAN

 Alat

o Neraca o Erlenmeyer
o Cawan Petri o Lampu Bunsen
o Jarum suntik o Gelas ukur
o Kapas o Tabung reaksi
o Gunting o Autoclave

 Bahan

o Bubuk media Blood o Aluminium foil

Agar Plate o Benang
o Aquades pH ± 7 o Darah golongan
(netral) darah O
o pH stick o Alkohol

 Pembuatan Media
 Alat dan bahan disiapkan.
 Bubuk media Blood Agar Base ditimbang sebanyak 40  gram kemudian
dimasukkan ke dalam botol kaca.
 Dilarutkan dengan 1000 ml aquades pH ± 7 (netral) kemudian dihomogenkan
menggunakan stirrer magnetic
 Botol kaca yang berisi media ditutup dengan tutup botol yang dilapisi
aluminum foil dan diikat dengan benang.
 Media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit.
  Media yang telah steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-500C.
 Ditambahkan 5-7% darah kambing
 Media dituang ke dalam plate dan ditunggu hingga padat.
 Setelah beku media siap digunakan
 Pengambilan Darah (Golongan Darah O)
 Alat dan bahan disiapkan
 Vena dibersihkan dengan kapas alkohol.Ditusuk vena dengan spuit dan
diambil darah sesuai kebutuhan
 Dilepasan jarum dan segera diletakkan kapas alkohol 70% di atas bekas
tusukan untuk menekan bagian tersebut selama 1-2 menit kemudian di plester.
 Darah golongan darah O siap digunakan untuk pembuatan media.

2. Pembuatan Media MCA

 Alat dan Bahan

 Alat

o Neraca o Erlenmeyer 250 mL

o Cawan Petri o Lampu Bunsen
o Batang Pengaduk o Gelas ukur 100 mL
o Kapas o Tabung reaksi
o Gunting o Autoclave

 Bahan

o Aquadest
o Mac Conkey Agar 51,5 g/L

 Pembuatan Media
 Persiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
 Dibuat bundel penutup Erlenmeyer
 Sterilisasi cawan petri, ke dalam oven dengan suhu 160 OC selama 2 jam
 Ditimbang Mac Conkey Agar sebanyak 10,3 g (untuk 10 plate), masukan
kedalam Erlenmeyer 250 mL, tambahkan 200 mL Aquadest
 Dipanaskan sambil diaduk sampai semua agar larut
  Diangkat Erlenmeyer, mulut Erlenmeyer ditutup menggunakan kapas yang
tadi di bundle, tutup dengan kertas dan diikat menggunakan karet
 Masukan kedalam Autoclave 121 oC selama 15 menit
 Diangkat dari autoclave setelah 15 menit, dinginkan hingga suhu 40 – 50 oC.
 Dituangkan kedalam cawan petri steril secara aseptic.
 Setelah beku dibungkus kertas. Meida siap digunakan.

3. Pembuatan Media Pseudomonas Cetrimide Agar (PCA)

 Alat dan Bahan

 Alat

o Neraca o Erlenmeyer
o Cawan Petri o Lampu Bunsen
o Batang Pengaduk o Gelas ukur
o Kapas o Tabung reaksi
o Gunting o Autoclave

 Bahan
o Media Pseudomonas Cetrimide Agar (PCA)
o Gliserol
o Aquadest
 Pembuatan Pseudomonas Cetrimide Agar (PCA)
 Timbang media Pseudomonas Cetrimide Agar sebanyak 45,3 gram
 Masukan media yang sudah ditimbang kedalam aquadest 1000 mL, tambahkan
10 mL Gliserol dan campurkan hingga rata di atas pemanas, dan
 Sterilkan di autoclave 15 menit pada suhu 121o.
 Diamkan media hingga suhu turun sampai 50 oC
 Cek pH di suhu 25 oC, pH 7,2 ± 0.2
  Lalu tuangkan ke cawan petri, biarkan hingga padat.

4. Cara Pembuatan Media Enrichment pada media Lactose Broth (Bakteri

Peudomonas sp.)

 Enrichment dengan Malachite Green Broth

 Media di timbang sebanyak 25 gram kemudian dimasukan kedalam wadah

steril.
 Tambahkan dengan Aquadest 1000 mL.
 Kemudian dihomogenkan hingga larutnya menjadi homogen satu sama lain.
 Pindahkan suspensi tadi ke dalam Erlenmeyer.
 Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit
 Masukan sampel kedalam media Enrichment
 Inkubasi pada temperatur 37 oC selama 18 – 24 jam
 Analisa
1. Pewarnaan Gram

 Jarum ose dipijarkan kemudian ditunggu hingga dingin, lalu bakteri diambil dari
media enrichment lalu diratakkan di atas preparat glass
 Kaca preparat dipijarkan hingga kering
 Larutan zat warna gentian violet diteteskan dan didiamkan selama 3 menit
 Preparat diberikan aquadest mengalir dan dikeringkan
 Larutan Lugol diteteskan dan dibiarkan selama 2 menit lalu bilas dengan alkohol
 Larutan Fuchsin diteteskan dibiarkan selama 1 menit
 Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
 Kaca preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x
Interpretasi Hasil :
 Bentuk : Batang
 Warna : Merah
 Susunan : Satu – Satu
 Gram : Negatif

2. Isolasi Inokulasi (Metode Gores)

 Panaskan ose bulat menggunakan api spiritus

 Ambil bakteri dari media enrichment menggunakan ose bulat
  Digores ose bulat ke media pada kaudran I secara sinambung sampai kuadran IV
 Diinkubasi bakteri pada inkubator pada suhu 35 oC ± 2 oC selama 24 jam
 Diamati pertumbuhan bakteri pada hari ke – 2

3. Identifikasi Koloni

 BA : Bulat, Ø 1 - 2 mm, putih keabuan, smooth, cembung, basah, hemolis

 MCA: Tidak tumbuh (karena dihambat oleh garam empedu)
 PCA : Bulat, Ø 1 – 2 mm, putih, cembung, pigmen hijau

4. Uji Biokimia

 Media Gula – Gula Pendek

Medianya cair, menggunakan ose bulat, dihomogenkan
Indikator : Phenol Red / Tabung Durham / Brom Cresol Purple
 TSIA
Agar miring, Ditusuk dan di oleskan dari dasar hingga lereng menggunakan ose
jarum
Indikator : Phenol Red dan besi (Fe)
 Simon Citrat
Agar Miring. Di oles dari dasar hingga lereng menggunakan ose jarum
Indikator : Brom Timol Blue (BTB)
 SIM (Sulfit Indol Motility)
Agar Tegak. Ditusuk 2/3 dengan ose jarum
Indikator : Kovach / Erlich
 Metil Red
Media Cair. Menggunakan ose bulat dan dihomogenkan
Indikator : Metil Red
 Voges Paskeur
Media Cair. Menggunakan ose bulat dan dihomogenkan
 Indikator : Alfa Naftol dan KOH
 Urea
Agar Tegak. Ditusuk sampai dasar menggunakan ose jarum
Indikator : Phenol Red

5. Pembacaan Uji Biokimia

No Sifat Biokimia Pseudomonas aeruginosa
1 MR -
2 VP +
3 Simon Citrat +
4 Sulfit -
5 Indol -

6 Motility +
7 Urea -
8 TSIA -/-
9 Glukosa -
10 Laktosa -
11 Sukrosa -
12 Manitol -
13 Maltosa -

6. Uji Resistant / Uji Sensitivitas

 Pengambilan Bakteri
 Menyiapkan alat dan bahan serta memakai masker dan handkun.
 Mensterilkan tangan menggunakan alkohol 70%.
 Mensterilkan jarum ose loop menggunakan korek api.
 Mengambil koloni bakteri dari tabung reaksi yang berisi bakteri dan
memindahkannya ke dalam medium BHIB.
 Mengaduk jarum ose loop tersebut sampai bakterinya tercampur dengan larutan
BHIB.
 Mengambil cairan BHIB yang berisi koloni bakteri tersebut dengan
menggunakan lidi kapas yang telah disterilkan. Pengambilan dilakukan dengan
 cara memasukkan lidi kapas ke dalam medium BHIB, mendiamkan selama 2-3
menit, kemudian mengangkat lidi kapas dengan menekan pada dinding tabung
bagian dalam sambil diputar-putar.
 Penanaman
 Mengoleskan lidi kapas yang telah berisi bakteri pada medium MHA dengan
meratakan seluruh permukaan medium.
 Mengambil disc antibiotik yang telah tersedia dengan menggunakan pinset.
 Menanamkan disc antibiotik tersebut pada medium MHA dengan

memperhatikan posisi antibiotik satu dengan yang lainnya.

 Menutup dan memberi label pada cawan petri tersebut sesuai dengan bakteri dan
kelompok.
 Membungkus cawan petri menggunakan kertas
 Menginkubasi cawan petri tersebut dalam inkubator dengan suhu 37oC selama
24 jam dengan posisi terbalik.
 Pengukuran
 Mengukur zona hambat yang terbentuk menggunakan mistar dengan cara
mengukur jari-jari zona hambat dan hasilnya dikalikan dua untuk mendapatkan
diameter zona hambat.
 Membandingkan zona hambat yang dihasilkan dengan tabel antibiotik.
 Mencatat hasil pengamatan dan mengambil gambar.
7. Skema Kerja Pseudomonas sp.
Spesimen : Makanan, Minuman, dan Lingkungan

Enrichment Media

Pewarnaan Gram : Gram negatif (-), Batang, Merah, Satu – Satu

Isolasi Pada media (BA, MCA, PCA) inkubasi suhu 37 oC selama 24 jam

Identifikasi koloni
 BA : Bulat, Ø 1 - 2 mm, putih keabuan, smooth, cembung, basah, hemolis
 MCA: Tidak tumbuh (karena dihambat oleh garam empedu)
 PCA : Bulat, Ø 1 – 2 mm, putih, cembung, pigmen hijau

Pewarnaan Gram : NaCl + Koloni ( Gram Negatif (-), batang, merah, satu – satu)

Isolasi pada media biokimia, inkubasi pada 37 oC selama 24 jam

Baca Hasil