Praktikum 1

Isolasi dan Identifikasi Bakteri Neisseria gonorrhoeae

Disusun oleh :

Nama : MERDA SRI RAHAYU

NIM : 20184323037
Prodi/Jurusan : DIV Analis Kesehatan Tk.3

Politeknik Kesehatan Kemenkes

Pontianak
 Identifikasi Niesseria Gonorrhoeae

Hari / Tanggal :

Rabu, 30 September 2020

Judul :

Identifikasi Niesseria Gonorrhoeae

Tujuan :

Mengamati ciri-ciri morfologi dan pertumbuhan Neisseria gonorrhoeae

Prinsip :

Sampel dilakukan pewarnaan Gram dan ditanam pada media untuk mendapatkan ciri spesifik
dari bakteri Neisseria gonorrhoeae

Dasar Teori :

Neisseria gonorrhoeae pertama kali dikenalkan oleh Albert Neisser pada 1879. Juga
dikenal dengan sebutan gonococci (jamak), atau gonococcus (tunggal), bakteri ini bersifat Gram-
negatif diplococcus serupa biji kopi yang menjadi penyebab penyakit gonorrhea (gonore), yaitu
satu infeksi menular seksual.
Spesies N. gonorrhoeae yang motil (bergerak dengan kedutan) memiliki Pili tipe IV untuk
menempel pada permukaan. Pili tipe IV beroperasi secara mekanik mirip dengan pengait. N.
gonorrhoeae dapat menarik 100.000 kali berat badan mereka sendiri dan sampai saat ini
dianggap bahwa pili adalah motor biologis terkuat yang dikenal, mampu mengerahkan satu
nanonewton.
N. gonorrhoeae memiliki protein permukaan yang disebut protein Opa, yang mengikat
reseptor pada sel-sel kekebalan. Dengan mekanisme itu N. gonorrhoeae mampu mencegah
respon imun. N. gonorrhoeae juga dapat menghindari sistem kekebalan tubuh melalui proses
yang disebut variasi antigenik, di mana bakteri ini mampu mengubah determinan antigenik
seperti protein Opa dan pili Tipe IV pada permukaannya. Banyaknya protein permukaan
membuat lebih sulit bagi sel-sel kekebalan tubuh untuk mengenali N. gonorrhoeae dan
menyusun imunitas.
Gejala infeksi N. gonorrhoeae berbeda tergantung pada tempat infeksi. 10% dari pria yang
terinfeksi dan 80% dari perempuan yang terinfeksi tidak menunjukkan gejala. Infeksi alat
kelamin dapat mengakibatkan nanah purulen dari alat kelamin yang mungkin berbau busuk.
Gejala mungkin termasuk peradangan, kemerahan, pembengkakan, dan disuria.
Infeksi alat kelamin pada wanita dengan N. gonorrhoeae dapat menyebabkan penyakit
radang panggul jika tidak diobati, yang dapat mengakibatkan infertilitas. Infertilitas disebabkan
oleh peradangan dan jaringan parut dari tabung falopii. Infertilitas adalah risiko 10 sampai 20%
dari perempuan yang terinfeksi N. gonorrhoeae.
Pasien gonore juga harus diuji untuk infeksi menular seksual lainnya, terutama infeksi
Chlamydia, karena ko-infeksi sering terjadi (sampai dengan 50% dari kasus). Cakupan obat
antibakteri sering termasuk untuk melawan Chlamydia.
Neisseria membutuhkan suplementasi nutrisi untuk tumbuh di dalam kultur laboratorium.
Secara khusus, mereka tumbuh pada agar-agar cokelat dengan karbon dioksida. Dari sebelas
spesies Neisseria yang menginfeksi manusia, hanya dua yang patogen.
Neisseria biasanya diisolasi di media Thayer-Martin agar, mengandung antibiotik dan
nutrisi yang memfasilitasi pertumbuhan spesies Neisseria sekaligus menghambat pertumbuhan
bakteri dan jamur pencemar. Pengujian lebih lanjut untuk membedakan spesies meliputi
pengujian untuk oksidase (semua Neisseria klinis yang relevan menunjukkan reaksi positif),
maltosa, sukrosa, dan glukosa.
Thayer-Martin agar adalah Mueller-Hinton agar yang mengandung 5% darah domba
cokelat dan antibiotik. Media ini digunakan untuk menumbuhkan dan mengisolasi
Neisseria patogen, yaitu Neisseria gonorrhoeae dan Neisseria meningitidis, dengan cara
menghambat pertumbuhan banyak spesies lain.
Kombinasi antibiotik yang terkandung pada Thayer-Martin agar dikenal dengan VCN
inhibitor, yaitu :
a. Vancomycin, yang mampu membunuh sebagian besar organisme Gram-positif, tetapi
beberapa Gram-positif lain seperti Lactobacillus dan Pediococcus  termasuk resisten
b. Colistin, yang mampu membunuh sebagian besar organisme Gram-negatif kecuali Neisseria,
meskipun organisme Gram-negatif lain seperti Legionella juga resistan
c. Nystatin, yang mampu membunuh sebagian besar fungi
d. SXT, menghambat organisme Gram-negatif, terutama yang bersifat swarming
seperti Proteus

Persiapan :

 Alat
- Plate
- Tabung reaksi
- Ose
- Lampu spiritus
- Pipet tetes
- Mikroskop
- Deck glass
- Cover glass
- Swab
- Incubator
- Batang pengaduk
- Beaker glass
- Erlenmeyer
- Hot plate
- Rak tabung

 Sampel

Tipe Sampel Cara Pengambilan

Ambil eksudat uretra. Jika tidak ada cairan yang keluar, kompres bagian
meatus secara vertikal untuk membuka uretra bagian distal dan sisipkan
Urethra
swab tipis yang dibasahi air berpelembab (kalsium alginat atau dacron),
putar perlahan dan tarik dengan lembut

Urin Pasien diminta mengambil 10 – 15 ml pertama dari urin. Pasien tidak boleh
Tipe Sampel Cara Pengambilan

buang air 2 jam sebelum pengambilan sampel untuk meningkatkan

kemungkinan organisme terdeteksi

Masukkan spekulum ke dalam vagina agar serviks terlihat. Masukkan swab

Serviks 1 – 3 cm ke dalam kanal endoservikal dan putar perlahan agar eksudat
terserap ke swab

Kumpulkan sekret vagina jika ada. Sampel cucian vagina adalah yang paling
disarankan dan diterima untuk wanita prepubertas. Bila tidak
Vagina
memungkinkan, gosokkan swab kapas steril berlawanan arah posterior
vagina agar sampel terserap ke kapas

Sampel mungkin tidak terlihat, disarankan menggunakan anoskop.

Rektal Masukkan swab 2 – 3 cm ke dalam anus. Hindari material feses. Biarkan
sampel menyerap ke dalam swab selama 10 detik

Gosokkan swab steril melewati bagian posterior faring dan tonsil. Pada bayi,
Orofaringeal
sampel didapat dengan cara mengambil aspirat nasofaring

Semua eksudat atau bus yang tampak pada mata diambil secara hati-hati
dengan swab steril. Swab kedua yang mengandung larutan salin digunakan
Konjungtiva
untuk mengusap konjungtiva. Swab ini harus dipatahkan di dalam tabung
media transport

Bersihkan kulit yang luka dengan iodin (1 – 2%, atau 10% larutan povidon-
iodin). Bila menggunakan iodin tinktur, cuci dengan etanol 70% untuk
Cairan tubuh
menghindari luka bakar. Lakukan aspirasi perkutan untuk pleural,
perikardial, peritoneal atau cairan sinovial

 Reagensia
Pewarna Gram
a. Gram A (Gentian Violet)
- Gentian violet 1 gr
- Alcohol 96% 10 ml
 - Fenol kristal 1 gr
- Aquadest add 100 ml
b. Gram B (Lugol)
- Yodium 1 gr
- Kalium iodide 2 gr
c. Gram C (Asam Alkohol)
- HCL pekat 3 ml
- Alcohol 96% 100 ml
d. Gram D
- Basic fuchsin 1 gr
- Aquadest 100 ml
 Media

Media non selektif cokelat agar dan media selektif Thayer-Martin, Martin Lewis, dan
New York City
Prosedur Pembuatan Media & Reagensia :

 Pembuatan Reagensia
Pewarnaan Gram

a. Kristal Violet
1. Timbang kristal violet yang dibutuhkan
2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke dalam botol gelap bertutup, beri label
b. Lugol
1. Timbang lugol yang dibutuhkan
2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke dalam botol gelap bertutup, beri label
c. Safranin
1. Timbang safranin yang dibutuhkan
2. Masukkan ke dalam beaker glass
3. Larutkan dalam aquadest, aduk hingga homogen
4. Masukkan ke9 dalam botol gelap bertutup, beri label

 Pembuatan Media
I. Media Coklat Agar (CBA)
- Timbang media Mueller Hinton sebanyak 10 gr
- Masukkan kedalam Erlenmeyer larutkan dengan 250 ml aquadest
- Panaskan lalu aduk hingga larut
- Sampling darah sebanyak 12,5 ml
- Masukkan darah ke erlenmeyer yang berisi potongan kaca
- Erlenmeyer digoyangkan membentuk angka 8
- Masukkan darah ke dalam media (media hangat kuku) yang disaring menggunakan
kertas saring
- Homogenkan Erlenmeyer membentuk angka 8
- Sterilkan media CBA menggunakan autoclave selama 15 menit
- Masukkan media ke dalam pertidisk di dalam ruangan tertutup menghindari
kontaminasi
- Setelah beku, bungkus media dan masukkan media ke dalam kulkas jika tidak
langsung digunakan

II. Media Thayer Martin

- Timbang media Thayer Martin sebanyak 10 gr
- Masukkan kedalam Erlenmeyer larutkan dengan 250 ml aquadest
- Panaskan lalu aduk hingga larut
- Sampling darah sebanyak 12,5 ml
- Masukkan darah ke erlenmeyer yang berisi potongan kaca
- Erlenmeyer digoyangkan membentuk angka 8
- Masukkan darah ke dalam media (media hangat kuku) yang disaring menggunakan
kertas saring
- Homogenkan Erlenmeyer membentuk angka 8
- Tambahkan antibiotic Vancomycin, Colistin, Nystatin, SXT, kemudian homogenkan
- Sterilkan media Thayer Martin menggunakan autoclave selama 15 menit
- Masukkan media ke dalam pertidisk di dalam ruangan tertutup menghindari
kontaminasi
- Setelah beku, bungkus media dan masukkan media ke dalam kulkas jika tidak
langsung digunakan

III. Media Martin Lewis

- Timbang media Martin Lewis sebanyak 10 gr
- Masukkan kedalam Erlenmeyer larutkan dengan 250 ml aquadest
- Panaskan lalu aduk hingga larut
- Sampling darah sebanyak 12,5 ml
- Masukkan darah ke erlenmeyer yang berisi potongan kaca
- Erlenmeyer digoyangkan membentuk angka 8
- Masukkan darah ke dalam media (media hangat kuku) yang disaring menggunakan
kertas saring
- Homogenkan Erlenmeyer membentuk angka 8
- Tambahkan antibiotic V. C. A. T, kemudian homogenkan
- Sterilkan media Thayer Martin menggunakan autoclave selama 15 menit
- Masukkan media ke dalam pertidisk di dalam ruangan tertutup menghindari
kontaminasi

IV. Media New York City

- Timbang media New York City sebanyak 10 gr
- Masukkan kedalam Erlenmeyer larutkan dengan 250 ml aquadest
- Panaskan lalu aduk hingga larut
- Sampling darah sebanyak 12,5 ml
- Masukkan darah ke erlenmeyer yang berisi potongan kaca
- Erlenmeyer digoyangkan membentuk angka 8
- Masukkan darah ke dalam media (media hangat kuku) yang disaring menggunakan
kertas saring
- Homogenkan Erlenmeyer membentuk angka 8
- Tambahkan antibiotic Vancomisin, kemudian homogenkan
- Sterilkan media Thayer Martin menggunakan autoclave selama 15 menit
- Masukkan media ke dalam pertidisk di dalam ruangan tertutup menghindari
kontaminasi
Prosedur Kerja :

Diagnosa terhadap infeksi lokal terdiri dari pewarnaan Gram dan kultur bakteri. Pada laki-
laki, dengan menemukan diplococcus Gram-negatif seperti biji kopi di dalam sel PMN dari
sampel uretra sudah cukup untuk diagnosa. Pada perempuan, mengandalkan hasil pewarnaan
Gram saja akan sangat sulit untuk menginterpretasikan, oleh karena itu kultur juga harus
dilakukan. Pewarnaan Gram terhadap sampel dari servis bisa saja positif palsu karena bisa
ditemukan diplococcus Gram-negatif pada flora normal, atau negatif palsu karena pengamatan
mikroskopis dengan obyektif 100x tidak dapat melihat bakteri gonococcus yang jumlahnya
sedikit. Kultur juga diharuskan untuk mendiagnosa tersangka dengan faringitis atau infeksi
anorektal.
 Mikroskopis
- Pewarnaan Gram harus segera dikerjakan setelah sampel didapat dari uretra, servis,
vagina, atau rektum
- Preparat uretra dari pria yang menunjukkan gejala biasanya didapat diplococcus
Gram-negatif bentuk biji kopi di dalam sel PMN (intrasel)
- Bila ditemukan ekstrasel saja berarti harus dipastikan dengan kultur atau tes asam
nukleat
- Preparat dari pasien perempuan lebih sulit diinterpretasi karena adanya Gram-negatif
coccobacilli, seperti Moraxella osloensis, Moraxella phenylpyruvica, Kingella
denitrificans dan Acinetobacter 
- Sensitifitas dan spesifisitas preparat uretra adalah 90 – 95%. Pada preparat
endoserviks sensitifitasnya 50 – 70% dan spesifisitasnya 90%
- Reliabilitas pemeriksaan mikroskopis tergantung kualitas sampel dan pengalaman
pemeriksan

 Kultur
 - Sampel primer diinokulasikan ke media non selektif cokelat agar dan media selektif
Thayer-Martin, Martin Lewis, dan New York City
- Inkubasi pada suhu 35 - 37°C pada kondisi CO2 3 – 7% selama 18 – 24
- Plate jangan diinkubasi lebih dari 48 jam karena biakan tua tidak dapat bertahan

 Penanaman media
- Panaskan ose bulat dengan spiritus hingga pijar
- Tunggu ose hingga dingin
- Ambil suspense swab menggunakan ose yang telah dipijarkan
- Buka tutup petridisk kemudian pijarkan
- Inkubasi pada permukaan media telurit pada empat bidang secara zig-zag
- Bungkus media lalu inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
- Amati pertumbuhan bakteri
Pembacan Hasil :
 Media Agar Coklat
Koloni gonococci berbentuk cembung, berkilau, meninggi, dan sifatnya mukoid berdiameter
1-5 mm. koloni transparan atau pekat, tidak berpigmen dan tidak bersifat hemolitik

 Media Thayer Martin

Koloni kecil berwarna abu abu, tembus terangkat

 Media Martin Lewis

Koloni kecil, warna putih keabu-abuan hinga tidak berwarna, koloni mukoid / berlendir
  Media New York City
Koloni kecil, cembung, warna transparan

 Pewarnaan Gram
bakteri Neisseria gonorrhoeae akan terlihat berwarna merah (Gram negatif) dan
berbentuk gonokokus

Pembahasan :
Identifikasi bakteri Neisseria gonorrhoeae dapat dilakukan dengan cara penanaman pada media
selektif seperti Thayer-Martin modifikasi, Pewarnaan gram dan uji biokimia yaitu uji katalase
dan uji oksidase.
Pewarnaan gram dilakukan dengan pengaplikasian pewarna dasar yaitu kristal violet. Pewarnaan
kedua dilakukan dengan menambahkan iodium, pada tahap ini semua bakteri akan berwarna
biru. Tahap yang ketiga yaitu pemberian pewarna ketiga yaitu alkohol, bakteri Gram positif akan
mempertahankan warna biru dari kristal violet, sedangkan warna biru yang berasal dari kristal
violet pada bakteri Gram negatif akan luntur sehingga bakteri menjadi tidak berwarna. Tahap
terakhir adalah pemberian pewarna kontras yaitu pewarna safranin, sehingga bakteri Gram
negatif yang tidak 13 berwarna akan berwarna merah yang berasal dari pewarna safranin .
Beberapa hal yang harus diperhatikan untuk mendapatkan hasil pewarnaan yang baik adalah (1)
umur biakan sebaiknya 18-24 jam; (2) zat warna yang digunakan dalam memiliki kualitas yang
baik; (3) hapusan bakteri yang dibuat preparat harus sedemikian tipis sehingga dapat
memperlihatkan morfologi bakteri setelah diwarnai. Pada Pewarnaan gram bakteri Neisseria
gonorrhoeae akan terlihat berwarna merah (Gram negatif) dan berbentuk gonokokus.

Daftar Pustaka :
1. http://repository.poltekkes-denpasar.ac.id/484/3/BAB%202.pdf
2. https://www.academia.edu/30399152/Pembahasan_Gonorhoeae
3. http://repository.poltekkes-denpasar.ac.id/484/