LAPORAN SEMENTARA BAKTERIOLOGI III

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Mycobacterium tuberculosis

DI SUSUN OLEH :

ANGGOTA KELOMPOK D :
1. Aisyah Daningrum Saputri
2. Alfiyah Novianty
3. Anky Frasatya
4. Aprilia Yovi Yoita
5. Endah Putri Syafitriyati
6. Febrizal
7. Hana Athalia Noya
8. Mela Azmi
9. Ni Putu Arsita Satya Putri
10. Ni Putu Natasia Putri
11. Rifki Khalidi Asyhaer
12. Risna Dewi Aryanti
13. Supiati
14. Yunita Ismi Nopianti
15. Yunita Primantari

POLITEKNIK KESEHATAN MATARAM KEMENKES RI

JURUSAN ANALIS KESEHATAN MATARAM
PRODI D-IV ANALIS KESEHATAN MATARAM
2017/2018
 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Mycobacterium tuberculosis

Hari / Tanggal : Senin, 2 April 2018 – Kamis, 5 April 2018

I. TUJUAN :
1. Mahasiswa dapat menyiapkan alat, bahan, dan reagen untuk keperluan
penanaman bakteri pada media pertumbuhan bakteri Mycobacterium
tuberculosis
2. Untuk mengetahui cara mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri
Mycobacterium tuberculosis
3. Untuk mengetahui morfologi dan ciri koloni serta sifat biokimia bakteri
Mycobacterium tuberculosis

II. DASAR TEORI :

Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit yang telah lama

dikenal dan sampai saat ini masih menjadi penyebab utama kematian di dunia.1
Prevalensi TB di Indonesia dan negaranegara sedang berkembang lainnya cukup
tinggi.2 Pada tahun 2006, kasus baru di Indonesia berjumlah >600.000 dan
sebagian besar diderita oleh masyarakat yang berada dalam usia produktif (15–
55 tahun). Angka kematian karena infeksi TB berjumlah sekitar 300 orang per
hari dan terjadi >100.000 kematian per tahun.3 Hal tersebut merupakan
tantangan bagi semua pihak untuk terus berupaya mengendalikan infeksi ini.
Salah satu upaya penting untuk menekan penularan TB di masyarakat adalah
dengan melakukan diagnosis dini yang definitif.
Mycobacterium tuberculosis merupakan salah satu spesies
Mycobacterium yang berbentuk batang dan tahan asam, sehingga biasa disebut
Bakteri Tahan Asam (BTA). Mycobacterium biasanya dapat hidup di air dan
berbagai sumber makanan.Mengingat asal sumbernya bervariasi, sudah tentu
akan mengandung mikroorganisme lain sebagai kontaminan . Dalam bidang
ilmu bakteriologi teknik isolasi Mycobacteria berbeda dengan teknik isolasi
bakteri lainnya . Banyak spesies dari Mycobacteria yang tumbuhnya lambat
sampai ada yang memerlukan waktu 6 minggu untuk bisa tumbuh pada media,
 sehingga untuk mengisolir agennya, bahan sampel harus dibebaskan dari
kontaminan . (Collin CH dkk. 1985, Corner LA 1989) .
Untuk penderita TB paru, sampel yang digunakan untuk mengisolasi
Mycobacterium tuberculosis adalah sputum penderita. Setelah dilakukan
pengisolasian, maka penting untuk melakukan analisis untuk memastikan apakah
bakteri yang diisolasi memang adalah Mycobacterium tuberculosis.

III. ALAT DAN BAHAN

 Alat :
- Labu erlenmeyer - Lampu spiritus
- Batang pengaduk - Objek glass
- Neraca triple beam - Mikroskop
- kertas timbang - Kertas dan Karet
- Gelas ukur - Tissue dan kain kasa
- Gelas beaker - Pipet tetes
- Tabung reaksi 5ml & 25ml - Incubator
- Rak tabung - Magnetic stirrer
- Ose bundar - Autoclave

 Bahan :
1. Media LJ (Lowenstein Jensen) - ZN B (Asam Alkohol)
- LJ 37,5 gram dalam 600 ml - ZN C (Meithylene Blue)
- Gliserol 12 ml 4. Alkohol 70%
- Whole egg 1.000 ml 5. NaOH 4%
2. Sampel Sputum 6. Larutan Pz
3. Pewarnaan BTA (ZeilNelsen) 7. Oil Imersi
- ZN A (Carbol Fuchsin)
IV. SKEMA
SAMPEL

KONSENTRASI
K

CAT Zhiel Nelseen

(+) (−)

DITANAM DI MEDIA STOP

KOLONI KOLONI
TUMBUH <10 TUMBUH >10

Mycobacterium non Mycobacterium

patogen patogen

CAT Zhiel Nelseen KESIMPULAN

V. CARA KERJA

Hari ke-1
1. Pembuatan media :
 Homogenisasi Telur
a) Dibersihkan telur bebek segar dengan cara menggosok permukaan luar telur
dengan sikat dan sabun.
b) Dibilas dengan air mengalir hingga bersih, kemudian keringkan
 c) Dicuci dan didesinfeksi tangan sebelum memegang telur yang bersih dan
kering.
d) Dipecahkan telur dan tampung dalam gelas beaker steril.
e) Dihomogenisasi telur dengan blender selama ± 2 menit (perhatikan , jangan
sampai terbentuk gelembung).
f) Disaring larutan telur dengan corong steril yang telah diberi kasa steril.
g) Diukur dengan gelas ukur steril sampai didapatkan volume telur 250 ml.
 Media Lowestein Jensen (37.5 gr/l)
a) Di sterilkan media LJ sebanyak 15 gr yang di tutup dengan alumunium foil
dalam autoclave (15 menit pada suhu 121oc, 1 atm).
b) Dilarutkan media LJ yang telah di steril ke dalam 250 ml telur bebek yang
telah dihomogenkan.
c) Ditambahkan 5ml gliserol dalam keadaan steril.
d) Dicampur perlahan – lahan dan hindari terbentuknya gelembung.
e) Dituang media ke dalam 15 botol bertutup ulir steril masing – masing 7 – 8
ml.
f) Disteril di dalam oven dengan suhu 800C dengan kemiringan 300 selama 1
jam dalam waktu 3 hari.
2. Pembuatan reagen :
 Pembuatan Larutan NaOH 4% (1N)
a) Dipipet 4 ml NaOH cons.
b) Dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest secara perlahan – lahan melalui
dinding dinding beaker.
c) Diaduk sampai homogen.
d) Dipindahkan ke dalam Erlenmeyer.
e) Disteril dalam autoclave (15 menit pada suhu 121oC, 1 atm).
f) Disimpan pada suhu ruang.
 Pembuatan 0,067 M PBS pH 6,8
a) Ditimbang Na2HPO4 anhidrat 9,47 gram, dilarutkan dalam 1000 ml
aquadest.
b) Ditambahkan KH2PO4 9,07 gram, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest.
c) Dicampur, dimasukkan ke dalam botol bertutup ulir.
 d) Diatur pH dengan menambahkan sedikit asam / basa agar mencapai pH 6,8.
e) Disteril di dalam autoclave 15 menit pada suhu 1210C dengan tekanan 1
atm.
f) Disimpan di lemari es.

Hari ke-2
1. Pengolahan sampel dahak (NaOH 4%)
a) Dituang sputum ke dalam tabung sentrifius 50 ml. jika lebih dari 10 ml,
ambil 10 ml bagian yang purulen, berdarah dan mukoid.
b) Ditambahkan NaOH 4% sama banyak.
c) Dicampur dengan vortex mixer sampai homogen. Diamkan dalam suhu
ruang. Masa kontak sputum dengan NaOH dibatasi 15 menit.
d) Ditambahkan larutan PBS sampai dengan 50 ml (jangan menuang langsung
PBS ke dalam tabung karena karena beresiko timbulnya cemaran silang).
e) Tutup rapat tabung di suhu ruang selama 15 menit untuk mengendapkan
aerosol.
f) Dituang supernatan ke dalam wadah berisi desinfektan. Diusap tepi tabung
dengan 95% etanol ( jangan sampai masuk ke dalam tabung).
g) Ditambahkan PBS 1 ml kedalam sedimen, dikocok agar homogen.
h) Setelah itu, sediaan dapat diinokulasi.
2. Inokulasi sampel pada media LJ
a) Dipipet 100 µl sedimen ke dalam media LJ atau Ogawa.
b) Ditutup botol tapi jangan terlalu rapat.
c) Disebar secara merata sampel sedimen di atas permukaan media dengan
cara menggerak – gerakkan botol.
d) Diletakkan botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada
incubator dengan suhu 370C.
e) Setelah 24 jam, dikencangkan tutup botol dan diletakkan botol pada rak
tabung dengan posisi tegak dan dilanjutkan diinkubasi.
f) Diamati pertumbuhan M. tuberculosis setiap minggu selama 20 sampai 28
hari.
g) Dicatat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan kultur.
VI. HASIL PENGAMATAN

SAMPEL SPUTUM
MEDIA
Makroskopis Mikroskopis

- Warna Koloni: Kuning Susu /Krem

LG - Bentuk : Bulat - Bentuk : Batang langsing panjang

- Elevasi: Cembung - Warna : Merah
(Lowerstein
- Permukaan: Tidak rata (seperti - Susunan : Monobasil - Diplobasil
Jensen) brokoli ) -Sifat : Gram Negative ( - )
- Tepian: Tidak rata
“Tidak Dilakukan Pengamantan Secara
Mikroskopis”
- Warna Koloni: Kuning Kecoklatan
- Bentuk: Bulat
- Ukuran: Besar
- Elevasi: Cembung
- Permukaan: Kering dan rapuh
- Tepian: Tidak rata

VII. PEMBAHASAN
Untuk mengidentifikasi bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat
dilakukan dengan penanaman sampel pada media Lowenstein-Jensen (LJ) yaitu
media berbahan telur ayam/bebek dengan syarat harus dalam keadaan segar
yang berumur tidak lebih dari 7 hari dan pakan ternak tidak boleh yang memakai
antibiotic, yang digabungkan dengan penggunaan elektrolit dan malachite green
untuk menghambat bakteri lain. Malachite green memiliki sifat bakteriostatik
 terhadap bakteri lain, dapat diinkorposikan ke dalam media tanpa menghambat
pertumbuhan basil tuberkel. Basil tuberkel masih dapat hidup dalam asam dan
alkali sehingga dapat membantu mengeliminasi / menghasilkan organisme
terkontaminasi sekaligus meningkatkan pertumbuhan dini dari Mycobacterium.
Penambahan gliserol bertujuan untuk dijadikan sumber karbon dan energy untuk
metabolisme dan mempercepat pertumbuhan M.tuberculosis.
Pada praktikum ini, sampel yang digunakan yaitu sampel penderita positif
tuberculosis yang diawal telah dilakukan pembuatan sediaan dari sampel sputum
dengan pewarnaan Ziehl-Nelseen. Ditemukan bakteri batang lurus berwarna
merah, tidak memiliki spora dan kapsul, tidak memiliki flagel. Diinokulasi di
dalam tabung tutup ulir media LJ yang sebelumnya dihomogenisasi terlebih
dahulu dengan H2SO4 4 % atau NaOH 4 %. Tujuannya homogenisasi adalah
untuk mencernakan sputum sehingga BTA yang terperangkap dapat lepas dari
jaringan pada sputum.
Didapatkan hasil pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis pada
dua tabung media LJ dengan cirri khas morfologi : koloni berwarna putih
kekuning-kuningan/kuning susu/krem (buff coloured), permukaan
bergelombang, kering dan rapuh dengan tepi yang tidak rata atau tidak beraturan
(seperti bunga kol), tidak berpigmen baik pada tempat terang maupun gelap
(buff). Sedangkan pada tabung lainnya terdapat media yang kontaminan oleh
mikroorganisme lain yang diduga jamur. Kontaminasi masih dapat terjadi
walaupun media LJ menggunakan malachite green untuk menghambat
pertumbuhan bakteri lain, bisa saja dari proses pembuatan media yang kurang
aseptis, proses inokulasi atau penanaman specimen yang kurang aseptis sehingga
media masih berpotensi terjadi kontaminasi pada media yang menyebabkan
mikroorganisme lain sepeti jamur tumbuh pada media LJ .

VIII. KESIMPULAN
Dari hasil praktikum “Identifikasi Mycobacterium tuberculosis“ untuk
menarik kesimpulan berdasarkan data morfologi dan ciri-ciri koloni secara
makroskopis dan mikroskopis yang diperoleh.
 Pada sampel sputum ditemukan bakteri batang lurus berwarna merah,
tidak memiliki spora dan kapsul, tidak memiliki flagel. Bakteri dengan
morfologi koloni tumbuh >10, berwarna kuning susu/krem (buff coloured),
permukaan bergelombang, kering dan rapuh dengan tepi yang tidak rata atau
tidak beraturan (seperti bunga kol), tidak berpigmen baik pada tempat terang
maupun gelap (buff) pada media LJ.
Berdasarkan hasil pengamatan makroskopis dan mikroskopis tersebut
dapat ditarik kesimpulan bahwa bakteri pada Sampel Sputum merupakan
bakteri dari spesies Mycobacterium tuberculosis non patogen.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Taufiqasharii. 2013. Isolasi dan Identifikasi Mycobacterium

http://taufiqasharii.blogspot.com/2013/12/isolasi-dan-
identifikasimycobacterium.html?m=1
Nursakinah. 2011. Analis Keshatan PraktikumV-VI
http://analiskesehatan18.blogspot.com/2012/04/praktikum-v-vi.html?m=1
Yazhidbashar. 2017. Makalah Mycobacterium Tuberculosis
http://www.atlm.web.id/2017/01/b-b-p-e-n-d-h-u-l-u-n-a.html?m=1
Anonym. 2010. Tuberculosis
http://repository.usu.ac.id/bitstream/handle/123456789/68039/Chapter%20II.pdf?
sequence=4&isAllowed=y

Praktikan Pembimbing Praktikum

( ) (Diaul Maftuha, Amd.AK.)