BAB 4

METODOLOGI
A. Alat dan Bahan Percobaan 1
Alat filtrasi autoclavable, membren filter ukuranpori-pori
filter 0.22 mikron,pompa vakum, botol steril, larutan trace
element atau bahan lainnya (antibiotic atau lainnya). Jarum
Ose, lambu bunsen, korek api, media padat dalam cawan
Petri, media padat dalam tabung. Cawan petri, tabung reaksi,
pipet ukur, kapas, kertas bungkus, benang kasur,oven, air
steril, media Potato DextrOse Agar (PDA) atau Nitrient Agar
(NA) dalam tabung reaksi dan Erlenmeyer, cawan Petri steril,
incubator, kertas sampul coklat, kapas benang kasur,susu,
penangas, panic, kompor.
Alat dan Bahan Percobaaan 2
Bahan-bahan yang disiapkan meliputi air suling
(aquades), kaldu pepton, Nutrient Agar (NA) : media dasar
untuk bakteri, dan Potato DextrOse Aagar (PDA) : media dasar
untuk fungi. Peralatan yang digunakan terdiri dari tabungtabung reaksi bersih,cawan Petri bersih, gelas ukur, labu
Erlenmeyer, gelas kimia, pipet volum, pembakan Bunsen, rak
tabung, kepas berlemak, alumunium foil/kertas kraft, benang
kasur, autoklaf, Laminar Air Flow cabinet, incubator
B. Cara Kerja Percobaan 1
Sterilisasi dengan filtrasi
1. Sterilkan alat filtrasi dan botol penampung filtrate,
kemudian rangkai alat tersebut beserta pompa vakum.
2. Membran filter steril diletakan secara aseptis dengan
menggunakan pinset steril pada dasar penompang filter.
3. Bahan yang difiltrasi dituang, kemudian pompa vakum
dihidupkan.
4. Filtrat yang telah ditampungdi dalam botol
penampungtelah steril dan siao digunakan untuk perlakuan
selanjutnya.
Sterilisasi dengan pembakaran
1. Nyalakan lampu bunsen dan atur nyala apinya secara
maksimal.
2. Ambil jarum Ose kemudia lakukan pembakaran dengan
lampu bunsen mulai dari bagian pangkal kawat Ose secara
perlahan manuju ke ujung kawat jarum Ose. Pembakaran
jarum Ose dilakukan sampai kawatnya merah membara.
3. Jrum Ose yang dibakar dibiarkan dingin, selanjutnya siap
digunakan untuk mengambil/menginokulasi mikroba.
4. Perhatikan teknik transfer aseptis seperti yang dijelaskan
diatas.

Sterilisasi dengan panas kering.

1. Tangkupkan cawan petri bagian bawah dan tutupnya,
kemudian tutup dengan kertas bungkus dan susun cawan
petri(5-10 buah) dan ditali denganbenang kasur.
2. Ambil tabung reaksi yang masing-masing ditutup dengan
kapas, beberapa tabung (5-1- tabung) diikat jadi satu dan
dibungkus kertas kemudian ditali.
3. Pipet diukur ujung atas diberi sedikit sumbat kapas ( agak
longggar ) kemudian dibungkus dengan kertaspayung dan
diikat dengan benang kasur.
4. Semua alat tersebut dimasukan kedalam oven.
5. Oven dinyalakan pada suhu 175 Cdan setelah suhu
tersebut. Tercapai, sterilisasi dilakukan selama 2 jam.
6. Setelah selesai pemanasan, semua peralatan didinginkan
dan pada hari berikutnya siap dipakai.
Sterilisasi dengan panas basah bertekanan tinggi
(autoklaf)
1. Tutup tabung reaksi yang berisi PDA atau NA dengan
kapas, beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian
tutupnya dibungkus dengan kertas paying. Sisakan satu
tabung berisi media tersebut, tetapi tidak disterilkan.
2. Isi autoklaf dengan air sampai permukaan air dibawah
ansang/keranjang autoklaf.
3. Sambungkan autoklaf dengan sumber listrik dan nyalakan
autoklaf.
4. Masukan tabung reaksi berisi media ke dalam
ansang/keranjang autoklaf.
5. Tutup autoklaf dan kencangkan peutupnya dengan kuat.
6. Atur suhu, waktu dan tekanan yang diperlukan untuk
sterilisasi.Sterilisasi umumnya dilakukan pada 121 C dan
tekanan 1 atm. Selama 15 menit.
7. Tanda digiyal pada autoklas menunjukan selama sterilisasi
berlangsung. Sterilisasi berakhir secara otomatis bila tanda
telah menunjuka complete.
8. Pada saat akan membuka tutup autoklaf, pastikan suhu
sudah turun sekitar 60 C dan tekanan sudah nol.
9. Buka tutuk autoklaf dan ambil media yang telah disterilkan.
Untuk media agar miring, siapkan serbet yang telah
digulung kemudian taruh tabung berisi agar diatasnya
dengan kemiringan sekitar30 derajat. Untuk media dalam

Erlenmeyer, sebelum dituang, media didinginkan terlebih

dahulu sampai suhu sekitar 45 C.
Sterilisasi dengan teknik Pasteurisasi.
1. Siapkan kompor dan penangas. Isi air secukupnya.
Mauskan susu kedalam wadah yang tahan panas. Masukan
wadah tersebut kedalam penangans
2. Pasteurisasi dilakukan pada suhu 70-80 C selama 15-20
menit.

Cara Kerja Percobaan 2

Media yang digunakan dalam praktek mikrobiologi
sebagian besartelah tersedia di pasaran dalam bentuk serbuk
yang siap dilakukan dengan pelarut yang sesuai dengan
jumlah tertentu, baik media padat maupun cair dapat
dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1. Tempatkan serbuk media sejumlah yang diperlukan ke
dalam wadah yang sesuai.
2. Tmbahkan setengah dari jumlah air suking yang diperlukan
dan campur baik-baik. Jika perlu, media yang mengandung
agar didiamkan kurang lebih 5 menit, kemudia tambahkan
sisa air suling.
3. Panaskan hingga mendidih, didihkan selama 1-2 menit.
4. Ukur pH, setelah pH yang diperlukan tercapai, masukan
dalam Erlenmeyer atau botol, tutup dengan tutupkapas
berlemak.
5. Sterilkan
Membuat beberapa media
Setelah masing-masing dilarutkan dalam pelarut yang
dilakukan dalam pelarut yang sesuai dengan jumlah yang
sesuai, buatlah beberapa media sebagai berikut :
a. Media cair (kaldu pepton)
1. Masukan media cair kaldu pepton sebanyak 5 ml
menggunakan gelas ukur ke dalam tabung reaksi yang
bersih., kemudian tutup engan kapas berlemak.
2. Lakukan sterilisasi akhir menggunakan autoklf.
b. Media agar tegak
1. Masukan nutrient agar cair hangat ( yang masih cair )
masing-masing sebanyak 5 ml ke dalam tabung-tabung
reaksi yang berih, beri sumbat tebung dengan kaps
berlemak.
2. Lakukan sterilisasi dengan autoklaf
3. Setelah steril da dikeluarkan dari autoklaf, letakan
tabung yang bersih media agar ini pad arak tabung
denga posisi tegak, biarkan memadat.
c. Media agar miring

1. Masukan nutrient agar cair hangat ( yang masih cair )

dan media PDA msing-masing sebanyak 5 ml ke dalam
tabung-tabung reaksi yang bersih, kemudian sumbat
dengan kapas berlemak.
2. Lakukan sterilisasi akhir dengan menggunakan autoklf.
3. Setelah steril dan dikeluarkan dari autoklf, letakan
tabung yang berisi media agar ini pada suatu
penyangga dengan posisi miring sekitar 30 derajat,
biarkan hingga memadat.
d. Media agar lempeng
1. Secara aseptis, pindahkan sebanyak 15-20 ml media
agar (NA dan PDA) yang masih dalam keadaan cair dan
telah steril, dituang dengan menggunakan ke dalam
gelas ukur ke dalam cawan-cawan peti yang juga steril,
biarkan hingga agar memadat.
Untuk memastikan bahwa media-media yang telah dibuat
dan disterilisasi telah steril, maka media-media tersebut
diuji sterilisasinya dengan cara mengikubasi media-media
tersebut pada incubator yang sesuai ( media untuk
bakteri : incubator suhu 35-37 C selama 18-24 jam, media
untuk jamur : incubator suhu 20-25 C selama 3-5 hari).