PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI I. Pelaksanaan praktikum a.

Tujuan: Mempelajari cara menyiapkan medium tumbuh bakteri Memahami prosedur sterilisasi menggunakan autoclave

b. Waktu pelaksanaan: c. Tempat pelaksanaan laboratorium mikrobiologi dan

laboratorium botani FKIP UNRAM

II.

Bahan dan Alat a. Bahan 1. NA 2. NB 3. Aquades 4. Karet gelang 5. Kertas jagung 6. Aluminium foil 7. Kapas 8. Lidi

b. Alat 1. Autoclave 2. Hote plate dan magnetik stirer 3. Gelas kimia 4. Tabung reaksi dengan tutup ulir 5. Tabung erlenmeyer 6. Petri disk 7. Rak tabung reaksi gelas ukur 8. Mikropipet dan tips

III.

Cara kerja

a. Pembuatan media NA: Nutrien agar adalah medium umum. NA digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Langkah-langkah pembuatan NA : 1. Menimbang NA sebanyak 28 gr 2. Menambahkan akuades sampai 1000 ml 3. Memanaskan dengan hot plate dan diaduk menggunakan magnetik stirer 4. Ditunggu sampai warnanya menjadi bening sekitar 15 menit 5. Dimasukan kelompok 6. Ditutup dengan sumbat kapas kemudian kertas jagung 7. Disterilisasi dengan autoclave NB Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kandungannya sama dengan NA hanya saja tidak menggunakan Agar sebagai pemadat. Langkah-langkah : 1. Menimbang NB sebanyak 7,5 gram 2. Menambahkan akuades sebanyak 600 ml 3. Memanaskan dengan hot plate sebentar, kurang lebih 5 menit 4. Menuangkan ke dalam tabung reaksi masing-masing tabung 10 ml kedalam erlenmeyer 80 ml masing-masing

5. Menutup tabung reaksi,membungkus, kemudian 6. Disterilisasi menggunakan autoclave.

Kapas swab
1. Memotong lidi kurang-lebih seukuran 10-15 cm 2. Melilitkan kapas pada salah satu ujungnya 3. Membungkus dengan kertas jagung 4. Sterilisasi dengan autoclave

b. Sterilisasi alat dan bahan 1. Membungkus alat bahan yang akan disterilisasi menggunakan kertas jagung dan diikat menggunakan karet 2. Tuangkan aquades kedalam autoclave kurang lebih 3 liter 3. Menata alat bahan yang akan disterilisasi dalam wadah aluminium 4. Letakkan tutup sterilisator pada tubuh sterilisator dengan cara mempertemukan tanda-tanda panah penunjuk. Kencangkan mur secara berpasangan agar alat tertutup sempurna 5. Membuka pengaturan klep pengaman 6. Menghubungkan alat dengan listrik, menekan tombol on dan mengatur waktu. 7. Bila uap air keluar dengan deras (menimbulkan bunyi mendesis) tutuplah klep pengamana 8. Membiarkan alat sampai alat penunjuk tekanan akan menunjuk angka 15 Pa. Akan terdengar bunyi seperti bunyi peluit 9. Menekan tombol off, dan memutuskan arus listrik. 10. Menunggu sampai petunjuk tekanan kembali ke 0 11. Membuka klep pengaman secara perlahan 12. Membuka baut secara berpasangan 13. Mengeluarkan alat dan bahan yang sudah disterilisasi ( untuk lebih lengkapnya cara kerja ada di laboratorium mikrobiologi)

c. Prinsip kerja autoclave Autoklave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 lb (2 atm) dan suhu 121C. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media digunakan suhu 121C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121C atau 249,8F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 lb. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian yang sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan mendidih pada suhu 121C. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 lb. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 lb. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba penguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik . Kondisi-kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf adalah sebagai berikut :

Suhu 111,5C, waktu 30 menit

Suhu 121,5C, waktu 20 menit

Suhu 126,5C, waktu 15 menit

Metode ini biasanya digunakan untuk mensterilisasi: Larutan dengan pembawa air Alat-alat gelas Pembalut untuk bedah