BUKU PENUNTUN

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI & VIROLOGI

FAKULTAS KEDOKTERAN
PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS
UNIVERSITAS PRIMA INDONESIA
MEDAN
2022
 Pas Foto

3 x 4 cm

BUKU PANDUAN MAHASISWA

Nama :

NIM :

No HP :

Email :
 MATERI PRAKTIKUM

1. Persiapan alat dan cara-cara sterilisasi alat

2. Pembuatan media dan larutan pengencer serta sterilisasi media dan larutan pengencer
3. Inokulasi biakan bakteri dan jamur serta pengenceran suspense bakteri dan jamur
4. Pengecatan gram
5. Pemeriksaan jamur
6. Uji biokimia terhadap beberapa bakteri
7. Penetapan angka lempeng Total bakteri dan jamur
8. Uji angka paling mungkin (MPN) koliform dalam sampel
9. Uji sterilitas sediaan steril dan alat kesehatan
10. Uji aktivitas pengawet
11. Uji angka fenol
12. Pengujian konsentrasi hambat minimum (KHM)
 PERCOBAAN I
PERSIAPAN ALAT DAN CARA-CARA STERILISASI ALAT

Tujuan : Mahasiswa/i memahami dapat melakukan cara sterilisasi pada media dan
peralatan penting dalam pekerjaan mikrobiologis.

Alat-alat :
1. Autoklaf
2. Oven
3. Mat Pipet
4. Cawan Petri Besar dan Sedang
5. Gelas Ukur
6. Beker Glass
7. Kapas Berlemak
8. Tali Pengikat (Benang)
9. Pinset
10. Jarum Ose Bangkok dan lurus
11. Gunting
12. Batang Pengaduk
13. Tabung reaksi
14. Labu erlenmeyer
15. Hot Plate
16. Pembakar Bunsen
17. Pipet Serologi
18. Pro Pipet
19. Spatula
20. Timbangan
21. Aluminium Foil
22. Magnetic stirrer
23. Water bath
24. Kulkas
Bahan-bahan
1. Nutrient Agar (NA)
2. Larutan Natrium Klorida (NaCl)
3. Plate Ciunt Agar (PCA)
4. Potato Dextrose Agar (PDA)
5. Aquades
6. Alkohol 70%
7. Nutrient Broth (NB)

Cara Kerja:
1. Sterilisasi Basah
a. Periksa autoklaf dan periksa air yang terdapat pada tabung air, jika air tidak mencapai
garis batas, tambahkan aquades
b. Siapkan alat-alat yang akan disterilisasi (tabung reaksi, erlenmeyer, pipet serologi,
cawan petri, dll) dibungkus kertas dengan baik dan diberi label
c. Pintu autoklaf dibuka dan masukkan alat atau bahan yang akan disterilkan
d. Pintu autoklaf ditutup rapat
e. Putar tombol pengatur suhu sesuai dengan tingkat suhu yang diinginkan yaitu 121 C
f. Waktu diatur selama 15 menit, tekan tombol power
g. Setelah suhu mencapai 121 C, tombol pengatur suhu distabilkan selama 15 menit
h. Sterilisasi berakhir pada saat alarm berbunyi
i. Matikan tombol power. Tekan tombol pengatur air ke bawah, uap air akan tertarik
kembali ke tabung air, tombol dinaikkan kembali setelah bunyi gemuruh air tidak
terdengar lagi
j. Buka pintu autoklaf, biarkan beberapa saat hingga suhu dalam autoklaf turun. Alat
yang telah disterilkan dikeluarkan dari autoklaf

2. Sterilisasi Kering
a. Alat-alat gelas (cawan petri, pipet serologi, erlenmeyer, tabung reaksi, dll) dibungkus
dengan kertas, rapi dan diberi label
b. Peralatan tersebut dimasukkan ke dalam oven. Suhu dan waktu diatur pada suhu 180
C selama 2 jam. Tombol tenaga (power) dihidupkan
c. Setelah 2 jam, suhu diturunkan dan power dimatikan
 d. Peralatan yang telah disterilkan tersebut diambil dari oven dan diletakkan pada tempat
yang bersih.

PERCOBAAN II
PEMBUATAN MEDIA DAN LARUTAN PENGENCER SERTA STERILISASI
MEDIA DAN LARUTAN PENGENCER

Tujuan : Mahasiswa/i terlatih dalam penyiapan dan pembuatan media yang digunakan
dalam praktikum mikrobiologi seperti menimbang, menakar sesuai dengan
jumlah standar, melarutkan, mensterilisasi serta memperkirakan kebutuhan
peralatan yang dibutuhkan.

Alat-alat
1. Timbangan
2. Gelas ukur
3. Erlenmeyer
4. Gelas beaker
5. Magnetic stirerr
6. Spatula
7. Pembakar bunsen
8. Hot plate
9. Tabung reaksi
10. Cawan petri
11. Aluminium foil
12. Batang pengaduk

Bahan-bahan
1. Nutrient Agar (NA)
2. Potato Dextrose Agar (PDA)
3. Kapas
4. Benang wol
5. Aquadest

Cara Kerja:
1. Tentukan jumlah media yang diperlukan. Perkirakan banyaknya tabung reaksi dan cawan
petri yang diperlukan. Untuk membuat satu media cawan dibutuhkan sebanyak 15 ml dan
10 ml untuk tabung reaksi. Hitung jumlah tepung media dan aquades berdasarkan
formula (terdapat pada label kemasan media) sebanyak yang diperlukan
2. Sobek/ potong sedikit aluminium foil sebagai wadah tepung media
3. Gunakan spatula kering untuk mengambil tepung, lalu tepung ditimbang. Hindari kontak
langsung antara tepung dengan udara, karena tepung media bersifat higroskopis.
4. Tekuk aluminium foil segera setelah penimbangan dan beri tanda
5. Dengan hati-hati pindahkan pindahkan tepung yang sudah ditimbang ke dalam
erlenmeyer dengan spatula. Bilas spatula dengan aquades di atas erlenmeyer
6. Tambahkan aquades secara perlahan-perlahan, goyang erlenmeyer untuk melarutkan
tepung dengan aquades. Periksa pH sekitar 6-7 untuk media bakteri, 5-6 untuk media
jamur. Penyesuaian pH dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes NaOH 1 N atau
HSl 1N sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf. (Proses sterilisasi dapat menurunkan pH
sekitar 0,1-0,2)
7. Homogenkan media dalam erlenmeyer dengan meletakkannya di atas penangas air (water
bath) sekitar 15 menit, aduk terus perlahan-perlahan dengan batang gelas. Pilihan lain
dapat dilakukan dengan menggunakan pengaduk magnet (magnetic stirer) yang
dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diletakkan di atas hot plate.
8. Masukkan cairan media sebanyak 10 ml ke dalam tabung reaksi. Siapkan sumbat kapas,
dan tutup/masukkan sekitar 2,5 cm ke dalam tabung reaksi dan biarkan sekat 2,5 cm
menyembul ke luar tabung reaksi.
9. Pindahkan sisa media ke dalam erlenmeyer kecil dan ditutup dengan kapas. Perhatikan
agar isi erlenmeyer tidak lebih dari 60% untuk menyediakan tempat jika cairan
mengembang selama proses sterilisasi.
10. Beberapa tabung reaksi disatukan dan dibungkus dengan kertas. Kerjakan hal yang sama
untuk erlenmeyer.
11. Media kultur segera disterilisasi dalam autoklaf
12. Setelah proses sterilisasi, untuk membuat media miring, letakkan tabung reaksi di atas
papan miring dan biarkan hingga mengas/memadat
13. Untuk membuat media cawan, dinginkan agar hingga 45 C dengan cara mengalirkan air
di sisi luar erlenmeyer dengan menggunakan jari telunjuk dan jari tengah tangan kiri
sambil memanaskan mulut erlenmeyer dengan pembakar bunsen
14. Buka tutup cawan petri (lakukan di dekat bunsen) dengan sudut 45 C dan tuangkan media
secukupnya (15 ml) ke dalam cawan petri. Tutup kembali cawan petri dan panaskan
sisinya denga pembakar Bunsen. Panaskan juga mulut Erlenmeyer sebelum ditutup
kembali.
15. Susun cawan petri dan letakkan dalam kantung plastik untuk menhindari masuknya lalat
buah. Media sangat baik diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam untuk memeriksa ada
tidaknya kontaminasi.
 PERCOBAAN III
INOKULASI

Inokulasi biakan bakteri dan jamur serta pengenceran suspense bakteri dan jamur

Alat-alat
1. Cawan Petri
2. Tabung Reaksi
3. Labu Erlenmeyer
4. Pinset
5. Jarum Ose
6. Pipet
7. Kapas
8. Aluminium foil
9. Kain kasa

Bahan-bahan
1. Nutrient Agar (NA)
2. Potato Dextrose Agar (PDA)
3. Biakan Murni Bakteri
4. Biakan Murni jamur
5. PCA (Plate Count Agar)

Cara-cara inokulasi
1. Inokulasi aerob (agar miring)
2. Inokulasi anaerob (Agar tegak)
3. Penanaman dalam Petri (metode streak)
4. Penanaman dalam Petri (metode sebar)

Cara Kerja:
Teknik Isolasi Mikroorganisme:
1. Setiap kelompok menuangkan media NA dan PDA yang disediakan ke dalam cawan
petri, biarkan hingga memadat
2. Letakkan satu cawan petri I yang sudah berisi media dengan tutup terbuka di dalam
laboratorium dan petri II di luar laboratorium
3. Sentuh permukaa agar pada petri I dengan jari yang belum dicuci dengan deterjen dan
petri II dengan jari yang sudah dicuci dengan deterjen
4. Sentuh permukaan agar pada petri I dengan jari yang belum disapukan ke rambut dan
petri II dengan jari yang sudah disapukan ke rambut
5. Sebarkan 1 tetes air kran dengan hockey stick di atas permukaan agar petri I dan II
dengan 1 tetes suspense partikel tanah
6. Inkubasikan seluruh petri yang sudah diberi perlakuan di atas, dalam posisi terbalik
selama 24 jam pada suhu kamar

Metode Cawan Tuang (Pour Plate)

1. Siapkan 3 media PCA cair dalam tabung reaksi (15 ml, suhu 45 C) diberi label 1,2 dan 3
2. Sediakan 3 petri yang telah disterilkan dan diberi label 1,2 dan 3
3. Catat karakteristik koloni yang hendak dimurnikan
4. Dengan menggunakan jarum ose, sentuh koloni bakteriyang telah ditentukan dari biakan
campuran, lalu diinokulasikan ke dalam tabung 1, homogenkan dengan vortex (media
tidak boleh menyentuh kapas dan jarum ose diincenerasi)
5. Tabung media 2 diinokulasikan dengan 1 lup ose dari tabung dan dihomogenkan
6. Tabung media 3 diinokulasikan dengan 1 lup ose dari tabung 2 dan dihomogenkan
7. Tabung 1,2 dan 3 yang telah diinokulasikan dengan bakteri tersebut dituang ke dalam
cawan petri (sesuaikan labelnya)
8. Biarkan media memadat, lalu diikubasikan secara terbalik pada suhu 37 C selama 24-48
jam
9. Amati dan catat karakteristik pertumbuhan koloni, perhatikan ada tidaknya kontaminasi

Metode Cawan Sebar (Spread Plate)

1. Tuangkan media PCA cair ke dalam cawan petri dan biarkan memadat
2. Inokulasikan 1 lup ose dari suspensi biakan bakteri di bagain tengan permukaan media
3. Dengan menggunakan hockey stick sebarkan inokulum secara merata pada permukaan
media
4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu 37 C selama 24-48 jam
5. Amati karakteristik pertumbuhan koloni

Metode Cawan Gores (Steak Plate)

1. Tuang media PCA ke dalam cawan petri dan biarkan memadat
2. Sentuh permukaan koloni yang telah ditentukan dengan jarum ose, lalu goreskan pada
permukaan media
3. Inkubasikan secara terbalik pada suhu 37 C selama 24-48 jam
4. Amati pertumbuhan koloni
 PERCOBAAN IV
PENGECETAN GRAM

Tujuan : Untuk melihat golongan bakteri apakah gram (+) atau gram (-).
Prinsip : Daya ikat dari sifat dinding sel dan membrane luar dari suatu bakteri
terhadap larutan zat warna yang disebabkansifat kepolarannya.

Alat
1. Gelas benda/slide
2. Cover glass
3. Penjepit tabung
4. Tissue
5. Jarum Ose
6. Pembakar Bunsen

Bahan
1. Metilen blue
2. Safranin
3. Kristal violet
4. Malachite green
5. Gram iodine
6. Aseton alkohol
7. Botol aquades

Cara kerja
1. Objek glas dicuci alkohol lalu difiksasi
2. Teteskan satu tetes akuades pada objek glass lalu satu ose biakan koloni dihomogenkan
atau disuspensikan, ratakan dan keringkan dengan fiksasi.
3. Kemudian tambahkan satu tetes gentian violet lalu tambahkan satu tetes larutan logol,
ratakan lalu keringkan dengan fiksasi.
4. Dicuci objek glas dengan alkohol 70% sampai tetesan terakhir tidak berwarna, keringkan.
5. Kemudian tetesi satu tetes safranin. Biarkan 15-30 detik, cuci larutan safranin dengan
aquadest steril
6. Keringkan
7. Tetesi minyak imersi
8. Lihat pada mikroskop dengan pembesaran 100 kali.
9. Lihat warna dan bentuk bakteri

Ketentuan:
Bakteri gram (+) berwarna violet/ungu
Bakteri gram (-) berwarna merah jambu (pink)
 PERCOBAAN V
PEMERIKSAAN JAMUR

Tujuan
1. Mengetahui jenis-jenis fungsi mikroskopis
2. Mengetahui perbedaan struktur morfologi fungsi uniseluler dan fungsi berfilamen

Cara kerja:

Pengamatan struktur kapang

Pengamatan koloni saccharomyces cerevisae dan fungsi berfilamen yang terdapat pada roti,
jagung atau jeruk. Perhatikan perbedaan struktur masing-masing fungi di bawah mikroskop.

Pengamatan koloni Saccharomyces cerevisae

 PERCOBAAN VI
UJI BIOKIMIA TERHADAP BEBERAPA BAKTERI

Prinsip
Pertumbuhan staphylococcus aureus pada media lempeng yang sesuai, mereduksi
kalium telurit, menghidrolisa kuning telur dan mengkoagulasi plasma.

Alat
1. Pipet ukur mulut lebar
2. Batang gelas bengkok
3. Alat hitung koloni

Bahan
1. Brain Heart Infusion Broth (BHIB)
2. Baird Parker Agar ( BPA – EY)
3. Buffered Peptone Water (BPW)
4. Plasma kelinci
5. 5% emulsi kuning telur (EY) dalam Larutan NaCl (1:1)

Prosedur
1. Penyiapan sampel
Dengan cara aseptic dipipet 10 ml cuplikan, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer steril.
Ditambahkan 225 ml BPW. Dikocok hingga diperoleh suspensi homogen dengan
pengenceran 10-1. Disiapkan 2 tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9 ml BPW.
Dipipet 1 ml pengenceran 10 -1
ke dalam tabung yang berisi 9 ml BPW hingga diperoleh
suspense dengan pengenceran 10-2, dikocok sampai homogen. Dibuat pengenceran berikutnya
dengan 10-3. Dari contoh langsung dan dari setiap pengenceran dipipet 0,25 ml ke cawan Petri
berisi 15-20 ml BP- EY yang telah memadat dan dibuat duplo. Segera suspense disebar
ratakan dengan menggunakan gelas bengkok. Dibiarkan beberapa saat hingga inokulum
terserap dalam media. Untuk mengetahui sterilitas pengencer dan media dibuat uji blanko.
Pada satu cawan berisi BP-EY yang telah memadat dipipet 0,25 pengencer lalu disebar
ratakan dengan batang gelas bengkok, dan pada cawan yang lain hanya diisi media BP-EY.
Semua cawan Petri diinkubasi pada suhu 35 0-370 selama 24-48 jam dengan posisi dibalik.
Setelah 24 jam dipilih cawan dengan jumlah antar 20-200 koloni berwarna hitam mengkilat
dengan lingkaran cerah disekelilingnya. Posisi koloni diberi tanda dan diinkubasi dilanjutkan
hingga 48 jam. Seluruh koloni yang tumbuh selama periode inkubasi dengan cirri seperti di
atas dihitung. Bila dari pengenceran terendah diperoleh jumlah koloni spesifik <20 maka
dapat digunakan untuk ui konfirmasi.

2. Konfirmasi
Dipilih 10 koloni yang diduga sebagai Staphylococcus aures, masing-masing diinokulasi ke
dalam tabung berisi BHIB, diinkubasi pada suhu 35-37 0 selama 20-24 jam. Dipipet 0,1 ml
biakan BHIB ke dalam tabung reaksi steril, ditambah 0,3 ml plasma kelinci, diinkubasi pada
suhu 35-370 selama 4-6 jam. Diamati adanya koagulasi plasma. Jika terjadi koagulasi maka
dinyatakan Staphylococcus aures positif.

3. Perhitungan
Dihitung jumlah Staphylococcus aureus dari contoh berdasarkan presentase koloni uji yang
telah dikonfirmasikan sebagai Staphylococcus aureus, dikalikan 4 dan faktor pengenceran.
Misalnya perhitungan koloni dugaan pada pengenceran 10-2 adalah 56. Dari koloni yang
dikonfirmasi, 9 koloni dinyatakan sebagai Staphylococcus aureus. Maka angka
Staphylococcus aureus per ml contoh adalah:
56x9/10x4x102 = 20160 koloni
= 2x 104 koloni
 PERCOBAAN VII
UJI SALMONELLA DALAM SAMPEL

Prinsip
Pemulihan Salmonella pada media pengkaya non selektif, dilanjutkan dengan
inokulasi pada media pengkaya selektif dan diinkubasi pada 43 0. Kemudian dilakukan
identifikasi terhadap koloni spesifik dari media selektif. Salmonella dapat mereduksi bismuth,
tidak memfermentasi laktosa, tetapi dapat menghasilkan asam dari glukosa dan sukrosa serta
dekarboksilasi lisin dan bersifat antigenic.

Alat
1. Stomaker

Bahan
1. Lactose Broth (LB)
2. Tetrathionate Brilliant Green Broth (SCB)
3. Briliant Green Agar (BGA)
4. Bismuth Sulfite Agar (BSA)
5. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
6. Lysine Iron Agar (LIA)
7. Nutrient Agar (NA)
8. Pepton Dilution Fluid (PDF)
9. Larutan Natrium klorida 0,85%
10. Salmonella antisera polivalen O

Prosedur
1. Pra- pengkayaan
Dengan cara aseptic ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong stomaker steril, ditimbang
225 ml PDF. Dihomogenkan menggunakan stomaker selama 30 detik kemudian dipipet 10
ml ke dalam 90 ml LB, diinkubasika pada suhu 350-370 selama 18-24 jam.
2. Pengkayaan
Dengan cara aseptic dipipet biakan pra-pengkayaan masing-masing 10 ml ke dalam 100 ml
media TBGB dalam 100ml SCB. Kemudian keduanya diinkubasi pada 43 selama 24 jam.
3. Isolasi
Dari biakan TBGB dan SCB diinokulasi masing-masing 1 sengkelit pada permukaan BGA
dan BSA, kemudian diinkubasi pada suhu 350-370 selama 18-24 jam, koloni yang tumbuh
dimatikan. Biakan diduga Salmonella positif jika :
Pada BGA : koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah, dari translusen hingga
keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.
Pada BSA : koloni berwarna coklat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang dengan kilap
logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula coklat, jika masa inkubasi ditambah warna
koloni menjadi hitam.

4. Identifikasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan BSA, diinokulasi pada media NA, TSIA
dan LIA dengan cara tusukan dan goresan. Diinkubasi pada 35-370 selama 24 jam. Biakan
diduga Salmonella positif jika :
Pada TSIA : terlihat warna merah pada permukaan miring, warna kuning pada biakan di
dasar Tabung tanpa pembentukan hydrogen sulfide (hitam)
Pada LIA : terlihat warna ungu lebih tua, diseluruh biakan.

5. Uji serologi
Diambil 1 sengkelit biakan dari biakan NA miring dan disuspensikan dengan 1 tetes larutan
NaCl o,85% pada kaca objek. Jika terjadi segera aglutinasi, suspens tersebut tidak dipakai
untuk uji serologi. Jika tidak terjadi aglutinasi spontan, diteteskan antisera Salmonella
polivalen O pada suspense. Kemudian dihomogenkan dengan cara menggoyang kaca objek
atau mengguanakn sengakelit. Diamati selama 1 menit jika terjadi aglutinasi berarti
Salmonella positif.
 PERCOBAAN VIII
PENETAPAN ANGKA LEMPENG TOTAL BAKTERI DAN JAMUR

Prinsip
Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasi pada media
agar lempeng dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai

Alat
1. Alat hitung koloni
2. Pipet ukur mulut lebar
3. Stomaker

Bahan
1. Plate Count Agar (PCA + TTC)
2. Peptone Dilution Fluid (PDF)
3. 1% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) 0,5%

Prosedur
Dengan cara aseptic dipipet 10 ml cuplikan ke dalam kantong stomaker steril,
ditambahkan 90 ml PDF, dihomogenkan dengan stomaker selama 30 detik sehingga
terbentuk suspense homogen dengan pengenceran 10-1. Disiapkan 5 buah tabung yang
masing-masing telah diisi dengan 9 ml PDF. Dipipet 1 ml suspense 10-1 ke dalam tabung
yang berisi 9 ml pengencer PDF dikocok hingga diperoleh suspense 10-2. Pengenceran
berikutnya dilanjutkan hingga terbentuk suspense akhir dengan pengenceran 10 -6. Ke dalam
tiap cawan Petri dituang 15-20 ml media PCA+TTC (suhu 45 0). Cawan Petri diputar dan
digoyang sedemikian rupa hingga suspense tersebar merata.
Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji blanko. Setelah media
memadat, cawan diinkubasi pada suhu 350-370 selama 24-48 jam dalam posisi dibalik.
Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

Interpretasi hasil
1. Dipilih cawan Petri dari satu pengenceran yang menunujukkan jumlah koloni anatara 30-
300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap ml contoh.
2. Bila salah satu dari cawan Petri menunujukkan jumlah koloni 30 atau lebih dari 300
koloni, dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap ml contoh.
3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan
jumlah koloni 30-300, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat
pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil
perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar
dari dua kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di bawahnya, maka Angka
Lempeng Total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (missal pada
pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10 -3 jumlah koloni rata-
rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140x102). Bila hasil perhitungan pada tingkat tinggi
diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada
pengenceran di bawahnya, maka Angka Lempeng Total dihitung dari rata-rata kedua
tingkat pengenceran tersebut. ( Misal pada pengenceran 10 -2 jumlah koloni rata-rata 293,
pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41, maka Angka Lempeng Total adalah :
293/2 +410 x 102 = 351,2 x 102
4. Bila tidak ada satupun koloni dalam cawan maka Angka Lempeng Total dinyatakan
sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
5. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipoilih cawan dari
tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa sector dan dihitung
jumlah koloni dari satu sector. Angka Lempeng Total adalah jumlah koloni dikalikan
dengan jumlah sector, kemudian dihitung rata-rat dari kedua cawan dan dikalikan dengan
faktor pengenceran.
6. Jika jumlah koloni rata-rat dari 1/8 bagian cawan lebih dari 200, maka Angka Lempeng
Total dinytakan lebih besar dari 200x8 dikalikan faktor pengenceran.
7. Perhitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng Total hanya ditulis dalam dua angak.
Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari lima dan dibulatkan keatas bila
lebih dari liam. Sebagai contoh 523x 10 -3
dibulatkan menjadi 52x 10-4 untuk 83,6 x 10-3
dibulatkan menjadi 84x 10-3
8. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian cawan.
Maka dihitung koloni yang tumbuh di luar daerah “spreader”. Jika 75% dari seluruh
 cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keaadan seperti diatas. Maka dicatat sebagai
“Spr”. Untuk keaadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya
(pengujian ualang).
PERCOBAAN IX
UJI ANGKA PALING MUNGKIN (MPN) KOLOFORM DALAM SAMPEL

Prinsip
Pertumbuhan bakteri koliform setelah cuplikan diinokulasi pada media cair yang
sesuai, dengan mengamati adanya reaksi fermentasi dan pembentukan gas di dalam tabung
Durham.

Alat
1. Stomaker
2. Pipet ukur mulut lebar
3. Tabung reaksi dilengkapi tabung Durham

Bahan
1. Peptone Dilution Fluid (PDF)
2. Mac Conkey Broth (MCB)
3. Brilliant Green Lactose Bile 2% Broth (BGLB)

Prosedur
Dengan cara aseptic ditimbang 25 cuplikan ke dalam kantong plastic stomaker steril.
Ditambahkan 225 ml pepton dilution fluid (PDF) dan dikocok homogeny hingga diperoleh
suspense dengan pengenceran 10-1. Disiapkan 2 tabung reaksi, masing-masing berisi 9 ml
PDF. Dari hasil homogenasi pada penyiapan contoh pipet 1 ml pengenceran 10-1 ke dalam
tabung PDF pertama hingga dioperoleh suspense dengan pengenceran 10 -2 dan dikocok
sampai homogeny. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-3

1. Uji presumtif
Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi berisi 9 ml MCB yang dilengkapi tabung
Durham. Ke dalam tipa tabung masing-masing seri dimasukkan 1 ml suspense pengenceran.
Semua tabung diinkubasi pada suhu 37 selam 24-48 jam. Setelah 24 jam dicatat dan diamati
adanya gas yang terbentukdalam tabung Durham pada tiap tabung. Kemudian inkubasi
dilanjutkan hingga 48 jam dicatat tabung-tabung yang menunjukkan gas positif.

2. Uji konfirmasi
Biakan dari tbung yang menunjukkan uji presumtif positif dipindahkan satu sengkelit
ke dalamtabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37 selama 24-48 jam. Dilakukan pengamatan terhadap
pembentukan gas

3. Pernyataan hasil
Jumlah tabung yang positif gas dari uji konfirmasi dicatat dan dirujuk ke tabel MPN
(APM). Angka yang diperoleh pada tabel MPN menyatakan jumlah bakteri coliform dalam
tiap gram atau tiap ml contoh yang diuji.

Tabel MPN (cara 3 tabung)

Indeks MPN dan batas kepercayaan 95% bila digunakan 3 tabung
Jumlah Tabung Positif MPN per g/ml Batas kepercayaan 95%
1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi
0 0 0 <3 - -
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
 2
3 2 210 35 470
0
3 3 240 36 1300
1
3 3 460 71 2400
2
3 3 1100 150 4800
3
3 3 >2400 - -
Catatan:
Bila seri pengenceran yang digunakan melebihi dari yang tertera pada tabel, maka
hasil yang diperoleh dari tabel dikalikan faktor 10,100,1000 dan sebagainya. Misal: bila yang
dipilih adalah dari pengenceran 10-2, 10-3, 10-4, maka hasilnya dikalikan dengan 10. Bila yang
dipilih adalah pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 maka hasil dikalikan dengan 100.
 PERCOBAAN X
UJI STERILITAS SEDIAAN STERIL DAN ALAT KESEHATAN

Prinsip
Pertumbuhan jasad renik pada media tertentu yang diinokulasi dan diinkubasi pada
suhu yang sesuai.

Alat
1. Laminar airflow cabinet (lemari aseptic)
2. Pipet kamagome atau alat suntik

Bahan
1. Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
2. Tryptic Soy Broth (TSB)

Prosedur
Disiapkan 4 tabung berisi 15 FTM dan 2 tabung berisi 15 ml TSB. Ke dalam 2 tabung
FTM diinokulasi masing-masing 0,1 ml suspense Bacillus subsstilis ATCC 6633 (1000 spora
hidup per ml), ke dalam2 tabung FTM lainnya 0,1 ml suspense Clostridium sporagenes NIHJ
(1000 spora hidup per ml). ke dalam 2 tabungTSB masing-masing diinokulasikan 0,1 ml
suspense candida albicans NIHJ (1000 spora hidup per ml). pengujian ini dilakukan
bersamaan dengan uji sterilitas. Contoh tabung-tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 35-
370C dan TSB pada suhu 20-25 C selama tidak kurang dari 7 hari.

1. Uji efektivitas media

Sebanyak 4 tabung berisi masing-masing 15 ml FTM dan 2 tabung berisi 15 ml TSB
diinokulasi 1 ml contoh kee dalam semua tabung. Pada 2 tabung FTM diinokulasi masing-
masing 0,1 ml suspense Bacillus substilis ATCC 6633 (1000 spora hidup per ml). ke dalam 2
tabung FT<M lainnya 0,1 suspensi clostridium sporagenes NIHJ (1000 spora hidup per ml).
ke dalam 2 tabung TSB masing-masing diiokulasi 0,1 ml suspense Candida albicans NIHJ
(1000 spora hidup per ml). pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas contoh.
Tabung-tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 35-370 C dan TSB pada suhu 20-25 C
selama tidak kurang dari 7 hari.

2. Uji sterilisasi media

Sebanyak 2 tabung berisi masing-masing media 15 ml FTM dan 15 ml TSB dari bets
yang sama, diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang digunakan untuk
uji sterilitas.

3. Cara penetapan
Pengujian dilakukan dalam laminar airflow cabinet yang sebelumnay telah
disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan benzalkonium klorida 0,2% steril dan telah
dijalankan selama 30-60 menit. Secara aseptic diambil 2 bagian cuplikan seberat 250-500 mg
dari bagian paling dalam contoh atau keseluruhan contoh bila ukurannya kecil kemudian
masing-masing cuplikan dimasukkan ke dalam 100 ml FTM dan 100 ml TSB. Media FTM
diinkubasi pada suhu 35-370 dan media TSB 20-25 selama tidak kurang dari 14 hari.

4. Pengamatan dan penafsiran hasil ujji

Tahap pertama
Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, diamati secara
makroskopis dan pertumbuhan jasad renik di dalam semua tabung. Bila tidak ada
pertumbuhan dikatakan bahwa sampel memenuhi syarat sterilitas. Bila ada pertumbuhan dan
dapat dibuktikan dari pemantauan bahwa fasilitas pengujian, bahan yang digunakan, prosedur
pengujian dan control negative atau teknik aseptic yang salah digunakan pengujian, maka
dinyatakan tidak abash dan tahap pertama harus diulang. Bial ada pertumbuhan dan terbukti
pengujian tahap pertama abash, dilakukan tahap kedua.

Tahap kedua
Jumlah contoh uji minimum dua kali dari jumlah contoh pada pengujian tahap
peratama. Bila tidak terdapat pertumbuhan jasad renik, maka sampel dinyatakan memenuhi
syrat sterilitas. Bila ada pertumbuahan maka dinyatakan sampel tidak memenuhi syarat
sterilitas kecuali dapat dibuktikan bahwa tahap kedua tidak abash, dalam hal ini pengujian
tahap kedua dapat diulang dengan contoh dan cara yang sama.
 PERCOBAAN XI
UJI AKTIVITAS PENGAWET

Prinsip
Pengawet yang ada dalam sediaan, diuji daya gunanya dengan menambahkan
beberapa mikroba uji sebagai penantang. Daya hidup mikroba uji diamati sampai waktu
tertentu.

Alat
1. Vortex mixer
2. Alat penghitung koloni

Bahan
1. TSA (Tryptic Soy Agar)
2. PDA (Potato Dextrosa Agar)

Cara kerja
Ditimbang 20 gram sampel dimasukka dalam wadah steril. Tambahkan 0,1 ml
suspense inokulum bakteri S. aureus. Timbang 1 gram encerkan dengan media pengencer LB
9 ml, pengenceran 10-1 dan seterusnya sampai pengenceran 10-6 kemudian setiap pengenceran
tersebut dipipet 1 ml ke dalam petri masing-masing duplo lalu setiap petri dimasukkan 15 ml
kemudian diputar dan diratakan. Biarkan media memadat kemudian cawan di inkubas pada
suhu 35-37 0C selama 2 hari. Hitung pada hari ke7,14,21,28.

Suatu pengawet dinyatakan berdya guna jika :

Pada hari ke 14 jumlah bakteri yang masih memiliki daya hidup tidak lebih dari 0,1%
dari kadar awal. Selama 14 hari pertama jumlah ragi atau kapang yang masih memiliki daya
hidup tetap pada kadar awal atau berkurang juga sampai hari ke 28. Harus tetap atau
berkurang.
 PERCOBAAN XII
PENGUJIAN KONSENTRASI HAMBAT MINIMUM (KHM)

Pengujian konsentrasi hambat minimum (KHM) mikroba berdasarkan metode difusi

agar menggunakan pencadang logam atau gelas, dimana konsentrasi senyawa obat tertentu
dimasukkan ke dalam masing-masing pencadang kemudian diukur zona bening disekitar
pencadang sampai diperoleh konsentrasi senyawa oabat terkecil yang masih memberikan
daya hambat.

Bahan
1. Nutrient Agar (NA)
2. Nutrient Broth (NB)
3. Muller Hinton Agar (MHA)

1. Pengujian Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri senyawa obat tertentu (antimikroba)dilakukan dengan
metode difusi agar mengguanakan pencadang logam, bakteri yang digunakan antara lain
bakteri salmonella, B. Subtilis, Staphylococcus epidermis, Klensiella pneumonia, M. lutea, P.
acne, B. Pumilus, MRSA, Staphylococcus aureus, E. coli. Jamur yang digunakan antara lain
Candida albicans, Rhizopus oryzae.

2. Pengenceran Senyawa Obat (Amtimikroba)

Masing-masing sampel ditimabng sebanyak 200 mg kemudian dilarutkan dalam
DMSO atau etanol (pa) pada labu tentukur 10 ml sehingga dipoeroleh konsentrasi 20 mg/ml
selanjutnya dibuat pengenceran 10 mg/ml, 5 mg/ml dan seterusnya

3. Sterilisasi alat
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan terlebih
adahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 170 derajat selama 1-2
jam dan alat-alat jenis lainnya disterilakan di autoklaf pada suhu 121 derajat selama 15 menit,
jarum ose dibakar dengan lampu spiritus