Panduan Praktikum Kultur Jaringan

I. Sterilisasi Alat
Bekerja secara aseptik adalah prinsip paling utama dalam aktivitas pengamatan yang
berhubungan dengan mikrobia. Kesterilan ruangan, pengguna, alat dan bahan-bahan
mutlak diperlukan karena mikrobia tersebut berukuran sangat kecil, tidak kasat mata, mudah
tersebar, dapat hidup dimana saja sehingga dibutuhkan suatu keadaan yang benar-benar
steril. Sterilisasi adalah suatu proses mematikan mikroorganisme yang mungkin ada didalam
benda. Adapun prosedur pelaksanaan sterilisasi alat dan media yang digunakan dalam
kultur jaringan yakni sebagai berikut:
A. Alat
1. Autoklaf
2. Botol semprot alkohol
3. Botol eksplan
B. Bahan
1. Alkohol 70%
2. Plastik tahan panas
3. Karet gelang
4. Kertas label
C. Langkah Kerja
1. Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilisasi dengan kertas pembungkus,
2. Tempatkan alat dan medium yang akan disterilisasi ke dalam plastik tahan panas,
3. Buka tutup autoklaf,
4. Masukkan aquades kedalam autoklaf hingga penanda batas air,
5. Tempatkan alat dan medium ke dalam autoklaf, susun rapi,
6. Tutup autoklaf dan hidupkan autoklaf. Tunggu hingga suhu mencapai 121 °C dan
tekanan sebesar 1 atm/15 lb (kondisi sterilisasi), jangan lupa menutup katup uap
autoklaf.
7. Mulai sterilisasi selama 30 menit untuk alat sedangkan 15 menit untuk medium.
8. Setelah selesai, matikan autoklaf. Tunggu hingga tekanan turun hingga 0 atm (suhu
agak dingin)
9. Buka secara hati-hati penutup autoklaf.
10. Keluarkan alat dan media dari dalam autoklaf.
 II. Pembuatan Media Kultur

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman
dengan teknik kultur jaringan. Komposisi media untuk setiap jenis tanaman seringkali
berbeda-beda. Media dasar yang paling sering digunakan untuk kultur jaringan tanaman
adalah media MS. Media kultur jaringan tanaman umumnya terdiri atas bahan-bahan yakni
air destilasi atau aquades, garam-garam anorganik, ZPT, vitamin dan bahan organik lain,
gula dan agar-agar. Adapun prosedur pelaksanaan pembuatan media MS sebagai berikut :
A. Alat
1. Timbangan analitik
2. Autoklaf
3. pH meter
4. Magnetic stirrer
5. Beaker glass
6. Gelas ukur
7. Spatula
8. Botol kultur
9. Kertas label
10. Plastik
11. Karet gelang
B. Bahan
1. Media MS Instan
2. Gula/sukrosa
3. Agar
4. Aquades
C. Langkah Kerja
1. Timbang media MS sebanyak 4.43 gram menggunakan timbangan analitik.
2. Timbang gula/sukrosa sebanyak 30 gram menggunakan timbangan digital atau
analitik.
3. Tambahkan aquades sampai volumenya mencapai 1.000 ml
4. Ukur pH larutan dengan pH meter dengan mengatur pH media menjadi 5,6 – 5,8.
Untuk pH yang kurang dari 5,6 teteskan KOH/NaOH 1 N untuk menaikkan pH
hingga pH 5,6 - 5,8 tercapai. Akan tetapi bila pH lebih dari 5,8 teteskan HCl 1 N
untuk menurunkan pH hingga pH 5,6 - 5,8 tercapai.
5. Jika pH telah selesai, timbang agar sebanyak 7 gram dan masukkan kedalam
larutan media kemudian aduk hingga rata.
6. Masukkan larutan media ke dalam beaker glass kemudian diaduk dan dipanaskan
dengan menggunakan magnetic stirrer sampai mendidih dan larut sempurna.
7. Setelah media mendidih, tuangkan media ke dalam botol kultur sebanyak 20-25 ml
perbotol.
8. Botol kemudian ditutup dengan tutup plastik kemudian disterilkan dalam autoklaf.
Untuk autoclave standarnya adalah pada suhu 121 °C selama 15 menit.
9. Media hasil sterilisasi dibiarkan hingga dingin dan disimpan di keranjang
penyimpanan media diruang transfer.
10. Media kultur sebaiknya digunakan setelah 3 hari dari tanggal pembuatan karena
pada saat itu sudah dapat dipastikan media tidak terkontaminasi.