BAB II

TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

A. Teknik Sterilisasi
2.1. Tujuan
Mahasiswa mengetahui dan memahami teknik sterilisasi alat dan media serta
mahasiswa mampu melakukan teknik sterilisasi alat dan media dengan baik dan
benar menggunakan autoclave.

2.2. Tinjauan Pustaka

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang dapat
berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan panas
yaitu spora bakteri. Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa
pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi.
Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk
paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay, 1992).
Autoklaf adalah suatu bejana yang dapat ditutup, yang diisi dengan uap panas
dengan tekanan tinggi. Suhu didalamnya dapat mencapai 1150C hingga 1250C dan
tekanan uapnya mencapai 2 - 4 atm. Alat tersebut merupakan ruang uap berdinding
rangkap yang diisi dengan uap jenuh bebas udara dan dipertahankan pada suhu
serta tekanan yang ditentukan selama periode waktu yang dikehendaki. Kondisi
yang baik digunakan untuk sterilisasi adalah pada 15 Psi dan temperatur 1210C
selama 15 menit. Agar penggunaan autoklaf efektif, uap air harus dapat menembus
setiap alat yang disterilkan. oleh karena itu, autoklaf tidak boleh terlalu penuh, agar
uap air benar-benar menembus semua area. (Adji, Dhirgo dkk, 2007).
Pada umunya (tidak selalu) autoclave dijalankan pada tekanan kira –kira 15-
16 psi per (5 kg/cm3) pada suhu 121. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi
bergantung pada sifat bahan yang disterilisasikan, tipe wadah, dan volume bahan.
Misalnya 1000 buah tabung reaksi yang masing –masing berisi 10 ml medium cair
dapat disterilisasikan dalm waktu 10 -15 menit pada suhu 121oC, sedangkan jumlah
medium yang sama bila ditempatkan dalam 10 wadah berukuran 1 liter akan
membutuhkan waktu 20-30 menit pada suhu yang sama untuk menjamin
tercapainya sterilisasi (Schmidt,1994). Pada prinsipnya, sterilisasi autoklaf
menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Biasanya untuk mensterilkan media

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 9

 menggunakan temperatur 121oC dengan tekanan 2 bar selama 15 menit. Alasan
mengapa digunakan temperatur 121oC karena pada saat itu menunjukkan tekanan 2
bar yang akan membantu membunuh mikroorganisme dalam suatu benda. Untuk
tekanan pada atmosfer pada ketinggian di permukaan laut air mendidih pada
temperatur 1000 C, sedangkan autoklaf yang diletakkan pada ketinggian yang sama,
menggunakan tekanan 2 bar maka air akan mendidih pada temperatur 121oC
(Pratomo, 2017).

2.3. Alat dan Bahan

2.3.1. Alat
1. Tabung reaksi
2. Petridish
3. Beaker glass
4. Rak tabung reaksi
5. Autoclave
2.3.2. Bahan
1. Aquadest
2. Kapas berlemak
3. Kertas sampul cokelat

2.4. Prosedur Kerja

Tabel 2. 1. Prosedur Kerja dan Hasil Pengamatan Setrilisasi
No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
1 Mencuci tabung Dicuci
reaksi, beaker glass, menggunakan
dan petridish sabun dan air
mengalir

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 10

 No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
2 Membilas dengan Dibilas hingga
aquadest basah

3 Menutup tabung Ditutup harus padat

reaksi dengan kapas dan rapat
berlemak

4 Memasukkan tabung Dimasukkan satu

reaksi kedalam beaker persatu
glass

5 Menutup beaker glass Ditutup dengan

dengan kertas sampul rapat
cokelat

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 11

 No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
6 Memasukkan ke Dimasukkan beaker
dalam autoclave glass ke dalam
autoclave

Sumber: Dokumentasi Pribadi

2.5. Analisa dan Pembahasan

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang dapat
berkembang biak. Peralatan yang umumnya disterilisasi terbuat dari bahan gelas
atau kaca, plastik dan besi. Dalam melakukan sterilisasi perlu diketahui mana alat
yang terbuat dari bahan yang tahan dan tidak tahan panas maupun bahan yang
memiliki batas panas maksimal yang mampu diterimannya. Hal ini bertujuan agar
peralatan yang disterilkan tidak rusak.
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah autoclave. Autoclave adalah
suatu bejana yang dapat ditutup, yang diisi dengan uap panas dengan tekanan
tinggi. Pada praktikum yang sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC selama 15 menit
dan pada tekanan 15 psi. Alasan mengapa digunakan temperatur 121oC karena pada
saat itu menunjukkan tekanan 2 bar yang akan membantu membunuh
mikroorganisme dalam suatu benda. Untuk tekanan pada atmosfer pada ketinggian
di permukaan laut air mendidih pada temperatur 1000 C, sedangkan autoklaf yang
diletakkan pada ketinggian yang sama, menggunakan tekanan 2 bar maka air akan
mendidih pada temperatur121oC.

2.6. Kesimpulan
Praktikum sterilisasi yang dilakukan menggunakan alat yang disebut
autoclave. Sterilisasi dilakuku pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 15
psi yang bertujuan untuk membunuh semua jasad renik yang dapat berkembang
biak pada alat laboratorium

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 12

 2.7. Daftar Pustaka
1. Adji, D., Zuliyanti., Larashantyz, H. 2007, Perbandingan Efektifitas
Sterilisasi Alkohol 70% Inframerah, Otoklaf, dan Ozon Terhadap
Pertumbuhan Bakteri Bactilus Subtillis, J Sain Vet, 25(1): 18
2. Lay, B. W. And Hastowo. 1992. Mikrobiologi.Rajawali Press. Jakarta.
3. Schlegel, H. G. and K. Schmidt. (1994). Microbiology Six Edition.
Yogyakarta : Gajah Mada Universitas Press.
4. Pratomo .2017. Bab II Tinjauan Pustaka. Semarang :UNDIP

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 13

B. Pembuatan Media
2.1. Tujuan
Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami teknik pembuatan media serta
mampu melakukan teknik pembuatan media dengan baik dan benar.

2.2. Tinjauan Pustaka

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat –zat makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme
untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi di dalam media
berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan
media pertumbuhan dapat dilakukan dengan isolasi mikroorganisme menjadi kultur
murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. Bahan dasar
adalah air sebagai pelarut agar –agar (rumput alut) dimana agar –agar berfungsi
sebagai pemadat media (Machmud, 2008).
Media padat merupakan media yang mengandung banyak agar atau zat
pemadat kurang lebih 15% agar –agar sehingga menjadi padat. Media ini umumnya
digunakan untuk pertumbuhan bakteri atau kapang. Jumlah penambahan agar
tergantung kepada jenis atau kelompok mikrobia yang dipelihara. Kalau tidak
ditambahkan zat pemadat, umumnya dipergunakan untuk pembiakan mikroalga
tetapi juga mikroba lain, terutama bakteri dan ragi. Ada yang memerlukan kadar air
tinggi sehingga kadar atau jumlah agar –agar rendah, tetapi juga sebaliknya
(Suarjana, dkk.2017).
Nutrient broth adalah medium yang berbentuk cair dengan bahan dasar
ekstrak beef dan peptone. Perbedaan konsentrasi antara nutrient agar dengan
nutrient broth adalah bentuknya. Nutrient agar berbentuk padat sedangkan nutrient
broth berbenyuk cair. Susunan kimia sama –sama sintetik. Medium ini bewarna
cokelat yang memiliki konsistensi cair (Suaradani, dkk.2014)..

2.3. Alat dan Bahan

2.3.1. Alat
1. Hot plate
2. Beaker glass
3. Autoclave
4. Gelas ukur

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 14

 5. Gelas arloji
6. Batang pengaduk
7. Neraca analitik
2.3.2. Bahan
1. Nutrient broth 2gram
2. Agar batang 4 gram
3. Aquadest 200 ml
4. Kertas sampul cokelat

2.4. Prosedur Kerja

Tabel 2. 2 Prosedur Kerja dan Hasil Pengamatan Pembuatan Media
No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
1 Mencuci alat –alat Dicuci menggunakan
yang akan digunakan sabun dan air mengalir

2 Menimbagng agar Ditimbang sebesar 4

batang dengan neraca gram
analitik

3 Memotong agar Disobek kecil –kecil

agar batang

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 15

 No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
4 Menimbang nutrient Ditimbang sebesar
broth menggunakan 2gram
neraca digital

5 Menuangkan aquadest Dimasukkan aquadest

ke dalam beaker glass sebesar 200ml

6 Memanaskan aquadest Dipanaskan hingga

menggunakan hot mendidih.
plate

7 Memasukkan agar Dipanaskan hingga

batang dan nutrient larut
broth ke dalam
aquadest

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 16

 No Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
8 Mengaduk campuran Diaduk hingga larut
agar batang dan semua
nutrient broth

9 Membungkus media Dibungkus dan diikat

dengan kertas sampul dengan tali yang
cokelat sangat rapat

10 Memasukkan ke Dimasukkan dengan

dalam autoclave hati –hati

11 Menutup autoclave Diatur suhunya

dengan rapat sebesar 121oC dengan
tekana 15 psi selama
15 menit

Sumber: Dokumentasi Pribadi

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 17

 2.5. Analisa dan Pembahasan
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat –zat makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme
untuk pertumbuhannya. Pada praktikum ini menggunakan media padat. Bahan yang
digunakan untuk media adalah nutrient broth. Nutreint broth adalah medium yang
berbentuk cair dengan bahan dasar ekstrak beef dan peptone. Nutrient broth
merupakan media cair, sehingga dalam proses pembuatan media dibutuhkan zat
pemadat.
Zat pemadat yang digunakan adalah agar batang. Funsi dari penambahan agar
batang adalah untuk pemadat media. Saat penambahan agar batang harus diaduk
agar cepat larut saat pemanasan larutan media. Media agar nutrient broth sebelum
digunakan menjadi media pertumbuhan biakan harus distrerilisasikan terlebih
dahulu yang bertujuan untuk membunuh semua jasad renik yang dapat berkembang
biak dalam media.

2.6. Kesimpulan
Praktikum pembuatan media dilakukan dengan menggunakan bahan nutrient
broth dan agar batang. Agar batang sebagai zat pemadat, sedangkan nutrient broth
untuk nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme yang akan dibiakan dalam media
agar. Media agar sebelum digunakan harus distrerilisasi dulu agar menghilangkan
jasad renik yang mungkin dapat mengkontaminasi pada media.

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 18

 2.7. Daftar Pustaka
1. Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.
Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
2. Suaradani, dkk. 2014. Identifikasi E. Coli: H7 dari feses ayam dan uji
profil hemilisisnya pada media agar dan jurnal kedokteran.
Jakarta
3. Suarjana, dkk. 2017. Modul Isolasi Dan Identifikasi Bakteri. FKH:
Universitas Udayana

Laporan Praktikum Mikrobiologi Lingkungan 19