Laporan Praktikum Mikrobiologi

Sterilisasi dan Teknik Aseptis

Pembuatan Media

Oleh :
Nama : Wita Ramadhianty Kusuma
NIM : 1304617071
Kelompok :9
Tanggal Praktikum : 24 September 2019
Dosen : Dr. Dalia Sukmawati, M.Si
Annisa Wulan Agus U, S.Si., M.Si

Pendidikan Biologi B 2017

Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Jakarta
2019
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Mikrobiologi adalah cabang Ilmu Biologi yang mempelajari organisme berukuran
kecil atau biasa disebut dengan mikroorganisme. Mikroorganisme hidup di segala tempat
bahkan di dalam tubuh kita. Namun, karena ukurannya yang terlalu kecil, kita sulit untuk
menemukannya tanpa bantuan alat. Dalam mempelajari mikrobiologi, alat-alat
laboratorium merupakan unsur penting yang harus ada. Peralatan laboratorium juga harus
dalam keadaan steril untuk menunjang pembelajaran mikrobiologi agar tidak terjadi
kontaminasi dan dapat mencapai tujuan pembelajaran atau penelitian yang maksimal. Serta
tidak lupa dilakukan secara aseptis, seperti membersihkan meja terlebih dahulu
menggunakan alcohol 70%, membersihkan tangan, dan mengurangi hal yang dapat
menyebabkan kontaminasi yang membuat penelitian menjadi tidak berjalan lancar.

Sterilisasi adalah tindakan atau upaya untuk membebaskan alat atau media dari
mikroba, agar mikroba yang ingin kita amati terbebas dari mikroba lain. Dalam prosesnya,
sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu secara mekanik, fisika, dan kimia.
Sterilisasi dengan cara mekanik dilakukan dengan filtrasi atau oenyaringan, secara fisika
dengan pemanasan atau pemberian tekanan, dan secara kimia dengan pemberian
desinfektan. Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam lab mikrobiologi.
Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan
secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media.
Sterilisasi adalah proses untuk menjadikan alat-alat terbebas dari segala bentuk kehidupan.
Seperti yang telah disebutkan bahwa tujuan sterilisasi untuk mematikan mikroorganisme
yang tidak diinginkan agar tidak ikut tumbuh.

Setiap mikroba yang ingin diamati pasti melakukan metabolisme untuk tumbuh dan
berkembang. Mikroba membutuhkan nutrisi yang berasal dari lingkungannya, dan proses
metabolise nutrisi tersebut disesuaikan dengan kebutuhannya. Pada umumnya media untuk
menumbuhkan mikroba harus menyediakan air, senyawa sebagai sumber energi, dan
kondisi lingkungan yang sesuai. Media yang digunakan harus memenuhi persyaratan
dalam hal komposisi nutrisi, tidak mengandung senyawa antimikroba, memiliki pH, kadar
air dan tekanan osmose yang sesuai, dan juga harus steril.

Dalam pengklasifikasiannya, media dibagi menjadi beberapa macam, berdasarkan

konsistensinya, media terbagi menjadi 3 macam yaitu media cair, padat, dan media
semisolid. Berdasarkan komposisi bahan media, media terbagi menjadi media sintetik,
semi-sintetik, dan media alami, sedangkan berdasarkan fungsi, media terbagi menjadi 4
macam yaitu media umum, media selektif, media diferensial, dan media pengaya atau
penyubur yang masing masing media memiliki peranannya tersendiri.
B. Tujuan
 Mampu memahami pentingnya teknik aseptic dalam bekerja di laboratorium
mikrobiologi lingkungan.
 Mampu melakukan teknik aseptic.
 Mengetahui berbagai cara sterilisasi alat laboratorium maupun media
 Untuk mengenal alat alat yang digunakan untuk praktikum mikrobiologi, alat
sterilisasi, dan cara penggunaannya
 Mengetahui jenis-jenis media dan cara pembuatannya
 BAB II
METODOLOGI PRAKTIKUM
A. Alat dan Bahan
 Otoklaf atau pressure cooker.
 Kompor Gas dan Lampu Spiritus..
 Rak tabung reaksi.
 Spatula untuk pengaduk dan
penimbangan bahan.
 Tempat penyimpanan untuk alat-alat gelas yang telah disterilkan dan media nutrien.
 Baki, plastik, spidol, kertas label, kain lap/serbet.
 Yellow page
 Tali kasur

Alat-alat Gelas
 Cawan petri
 Tabung reaksi.
 Gelas/labu erlenmeyer.
 Gelas ukur.
 Corong gelas.

Bahan-bahan
 Alkohol 70 % dan 90 %, spiritus.
 Aquades steril.
 Desinfektan (karbol, lisol, spiritus, formalin, betadine, d1l)
 Bahan-bahan media pertumbuhan
mikroba (agar).
 Ekstrak daging sapi
 Ekstrak kentang
 Sukrosa
 Media nutrien

B. Cara Kerja
1. Teknik Aseptis
Pastikan meja kerja selalu bersih dari kotoran dan benda benda yang tidak
digunakan selama penelitian, bersihkan meja menggunakan alcohol 70 % sebelum
digunakan, sebaiknya letakkan alcohol 70 % atau pembersih lain selalu dekat dengan
meja kerja, setelah selesai bekerja bersihkan kembali meja dari peralatan yang telah
digunakan dan bersihkan lagi meja kerja. Selain meja kerja, perlatan yang akan
digunakan juga harus steril, beri label semua peralatan untuk memudahkan ketika
sedang bekerja, lalu bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan. Setelah
itu, atur alat yang ingin digunakan sedemikian rupa untuk memudahkan dan
meminimalisir pergerakan tangan, taruh alat yang biasa digunakan menggunakan
tangan kanan di sebelah kanan meja, dan sebaliknya, sediakan juga ruang lapang untuk
bekerja di tengah meja kerja. Karena semua alat yang dipakai harus steril, membakar
 mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang
menempel. Jika semua itu telah dilakukan, persiapkan alat dan bahan yang ingin
dipakai sesuai prosedur tertentu di meja kerja, usahakan tidak meninggalkan meja kerja
untuk mengambil alat dan bahan yang tertinggal, perhitungkan segala sesuatu yang
ingin digunakan. Lalu pakailah sarung tangan jika dibutuhkan dan gantilah secara
berkala, jika materi yang ingin diteliti dirasa tidak berbahaya, sarung tangan boleh tidak
dipakai, namun jangan lupa untuk mencuci tangan sebelum dan setelah bekerja
menggunakan desinfektan untuk menghilangkan mikroorganisme yang berada di
tangan.

2. Sterilisasi
Seperti yang kita ketahui, dalam melakukan penelitian di bidang mikrobiologi
segala sesuatunya haruslah steril, sterilisasi bertujuan untuk membebaskan alat atau
media yang ingin kita gunakan terkontaminasi dengan mikroba lain yang tidak
diinginkan. Alat yang digunakan untuk sterilisasi kali ini adalah autoclave, sebelum
memulai sterilisasi, pastikan air yang tertampung dalam autoclave telah mencapai batas
yang ditentukan, lalu masukan alat dan media yang akan disterilkan ke dalam autoclave
dengan rapih, jika sudah tutup autoclave dengan rapat dan kencangkan baut pengaman
agar tidak ada uap keluar, kencangkan baut pengaman sampai benar benar dirasa sudah
kencang dan tidak akan ada uap yang keluar. Letakkan autoclave diatas kompor, saat
sumber panas dinyalakan, air yang ada dalam autoclave akan mendidih dan uap air
yang terbentuk akan mendesak udara yang mengisi autoclave, setelah semua udara
dalam autoclave diganti dengan uap air, atau jika sudah ada asap keluar dari autoclave,
tutup katup uap sehingga tekanan udara dalam autoclave naik. Oleh karena autoclave
yang digunakan masih sederhana, jadi tidak ada timer yang mengatur sehingga dalam
proses sterilisasi ini, kita harus selalu melihat apakah autoclave tetap dalam kondisi
yang diinginkan. Tunggu hingga autoclave mencapai suhu 121 °C, jika sudah mencapai
suhu yang diinginkan, diamka selama 15 menit, pastikan suhu selalu stabil, setelah itu
matikan sumber panas dan biarkan suhu menurun dengan sendirinya, jangan buka tutup
autoclave jika suhunya belum mencapai 0°C, jika suhu sudah turun, buka tutup
autoclave dengan hati hati dan ambil media serta alat yang telah disterilkan.

3. Pembuatan Media
 PDA Sintesis (100 ml)
Pertama tama timbang PDA sebanyak 3.90 gram untuk 100 ml aquades
menggunakan timbangan digital, larutkan 3.90 gram PDA dalam 100 ml aquades
kedalam tabung Erlenmeyer dan aduk menggunakan spatula sampai tercampur
dengan rata. Setelah itu, panaskan larutan PDA yang telah tercampur tadi sampai
mendidih, selama pemanasan larutan PDA harus terus diaduk menggunakan
spatula. Apabila larutan PDA sudah mendidih,, angkat larutan tersebut dan siapkan
2 tabung reaksi. Tuang larutan PDA sintesis ke dalam setiap tabung reaksi sebanyak
5 ml dan tutup tabung reaksi menggunakan sumbat kapas, pastikan sumbat kapas
terpasang dengan rapih dan kencang. Lalu pasang label pada setiap tabung reaksi
 untuk menandai setiap tabung untuk memudahkan kita dalam melakukan
penelitian. Jika sudah, letakan tabung reaksi ke dalam gelas kimia dan tutup bagian
atas gelas kimia menggunakan yellow page dan ikat menggunakan tali kasur
dengan rapih. Selanjutnya sterilkan menggunakan autoclave. Tunggu hingga
autoclave mencapai suhu 121°C dan tunggu sampai 15 menit, pastikan suhunya
stabil. Jika dirasa sudah cukup, matikan autoclave dan tunggu hingga suhunya
menurun, lalu buka tutup autoclave dan ambil tabung reaksi yang sudah steril
dengan hati hati.

 PDA Alami (100 ml)

Kupas dan cuci bersih kentang, timbang kentang sebanyak 75 gr lalu
kentang dipotong dadu, tambahkan kurang lebih 150 ml aquades ke dalam 75 gr
kentang tersebut dan panaskan selama 20 menit, tidak boleh dipanaskan lebih atau
kurang dari 20 menit. Apabila air menyusut selama pemanasan, tambahkan lagi
aquades hingga hasil akhirnya 150 ml, setelah itu saring kentang yang telah direbus
menggunakan kertas saring hingga jernih. Lalu, timbang agar dan sukrosa masing
masing sebanyak 2 gr. Tuang ekstrak kentang yang sudah dibuat sebanyak 100 ml
ke dalam tabung Erlenmeyer dann tambahkan agar dan sukrosa yang telah
ditimbang, kemudian aduk hingga rata. Panaskan tabung Erlenmeyer sambil diaduk
menggunakan spatula sampai mendidih lalu angkat. Setelah itu, tutup mulut tabung
Erlenmeyer menggunakan sumbat kapas dengan rapih dan kencang. Lalu sterilisasi
menggunakan autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit, pastikan suhu selalu
stabil. Kemudian matikan autoclave dan tunggu hingga suhu menurun dan ambil
media tersebut dengan hati hati.

 NA Sintesis (200 ml)

Timbang NA sintesis sebanyak 4 gr terlebih dahulu, lalu masukan ke dalam
tabung Erlenmeyer, setelah itu tambahkan aquades sebanyak 200 ml ke dalam
tabung tersebut dan panaskan hingga mendidih, aduk menggunakan spatula selama
proses pemanasan, jika sudah mendidih angkat tabung Erlenmeyer dan tutup
menggunakan sumbat kapas dengan rapih, beri label tabung tersebut agar tidak
tertukar dengan tabung yang lain. Langkah selanjutnya adalah sterilisasi
menggunakan autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit.

 NA daging (100ml)
Pertama tama siapkan daging sapi sebanyak 75 gr tanpa lemak dan 150 ml
aquades, kemudian potong daging sapi menjadi beberapa bagian dan rendam
dengan aquades selama 1 malam, setelah direndam, rebus daging selama 20 menit,
jika sudah angkat dan saring rebusan daging menggunakan kertas saring untuk
mendapatkan ekstrak daging tersebut. Ekstrak daging yang dibutuhkan sebanyak
100 ml, jika ekstrak daging sudah cukup, tuang ke dalam labu Erlenmeyer. Lalu
siapkan 2 gr NA untuk ditambahkan ke dalam ekstrak, timbang NA terlebih dahulu
menggunakan timbangan digital, setelah itu tambahkan NA ke dalam ekstrak
 daging yang sudah terlebih dahulu dibuat dan aduk rata menggunakan pengaduk
agar NA dan ekstrak daging tercampur dengan rata. Setelah itu didihkan NA +
ekstrak daging yang telah tercampur diatas kompor yang telah diberi kawat kasa
diatasnya, selama proses pemanasan, aduk terus media menggunakan pengaduk
agar menjadi homogen. Jika sudah mendidih, angkat labu Erlenmeyer dengan hati
hati dan siapkan 2 tabung reaksi. Tuang media ke dalam tabung reaksi sebanyak
kurang lebih masing masing 5 ml, kemudian sumbat mulut tabung reaksi
menggunakan sumbat kapas dengan rapih agar tidak terjadi kontaminasi. Lalu taruh
tabung reaksi ke dalam gelas kimia, dan tutup gelas kimia menggunakan yellow
pages dan ikat menggunakan tali kasur agar yellow pages tidak lepas. Sterilkan
gelas kimia tersebut menggunakan otoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Jika
sudah, keluarkan tabung reaksi yang sudah steril da n letakkan pada rak tabung
reaksi untuk membuat media tegak, dan letakkan tabung reaksi di penyangga
tabung untuk membuat media slant.

 NB sintetis (100 ml)

Siapkan bubuk NB terlebih dahulu, lalu timbang menggunakan timbangan
digital sebanyak 0,8 gr untuk 100 ml aquades, larutkan bubuk NB ke dalam aquades
dan aduk menggunakan spatula sampai merata, kemudian tuang larutan NB ke
dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml, lalu sumbat mulut tabung reaksi menggunakan
sumbat kapas dengan rapih dan kencang. Taruh tabung reaksi ke dalam gelas kimia
dan tutup menggunakan yellow pages, kemudian ikat dengan tali kasur agar yellow
pages tidak lepas. Sterilkan larutan NB menggunakan otoklaf pada suhu 121 °C
selama 15 menit, kemudian ambil media jika suhu telah turun.
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
1. Teknik aseptis
Praktikan mengetahui dasar dasar penting yang harus dilakukan dalam
praktikum mikrobiologi, serta melakukan teknik aseptis dengan baik sebelum
dan sesudah memulai praktikum, sehingga alat dan bahan yang dipakai semua
terjaga kebersihannya, terhindar dari kontaminasi karena teknik aseptis yang
dilakukan.
2. Sterilisasi
Alat atau media yang telah disterilisasi terhindar dari mikroorganisme yang
tidak diinginkan, sehingga penelitian dapat berjalan sesuai dengan yang
diharapkan.
3. Pembuatan media
Pada praktikum kali ini, menghasilkan beberapa media seperti :
a. PDA sintesis 100 ml
b. Ekstrak Kentang + NA 100 ml
c. NA sintesis 200 ml dan 250 ml
d. Ekstrak Daging + NA 100 ml (media tegak dan media slant)
e. NB sintesis 100 ml

B. Pembahasan
1. Teknik Aseptis
Teknik aseptis adalah suatu system cara bekerja praktek yang menjaga
sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah
kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar
penggunaan teknik aseptis adalah adanya banyak partikel yang mengandung
mikroorganisme yang mungkin dapat masuk ke dalam alat atau mengendap di
area kerja. Pertumbuhan mikroba ini tidak diinginkan dan dapat memengaruhi
atau mengganggu hasil dari suatu percobaam. Penggunaan teknik aspetis
meminimalisir partikel yang digunakan terhadap agen pengontaminasi
(Schlegel, 1994)

2. Sterilisasi
Sterilisasi adalah sebuah proses untuk menghilangkan bakteri yang
ada pada peralatan baik itu yang bersifat patogen maupun apatogen. Dalam
melakukan suatu pengamatan terhadap obyek mikrobiologi mengharuskan kita
untuk menggunakan peralatan yang steril agar hasil pengamatan yang kita
lakukan sesuai dengan apa yang diinginkan. Dalam hal ini kontaminasi bakteri
lain pada hasil pengamatan sangat tidak diinginkan
3. Pembuatan Media
Dalam pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari nutrien media yang
dibuat. Kebanyakan mikroorganisme membutuhkan air. bahan-bahan yang
terlarut di dalam air yang digunakan mikroorganisme untuk membentuk badan
sel dan memperoleh energi yang berasal dari bahan makanan. Perbedaan antara
medium NA dan medium PDA yaitu terdapat pada nutrien penyusunnya. Pada
medium NA, nutrien utama penyusunnya yakni adalah kaldu sedangkan
medium PDA nutrien utama penyusunnya terdapat pada kentang. Karena itu
nutrient ini dinamakan Potato Dextrose Agar.Nutrient Agar (NA) merupakan
suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara bahan
alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak daging
dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan
sebagai pemadat, karena sifatnya yang mudah membeku. Dalam hal ini ekstrak
daging digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber
protein,nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh
mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Medium Nutrient Agar (NA)
merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi
yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan
sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri.Medium PDA (Potato Dekstrosa
Agar) berdasarkan susunannya merupakan medium organik semi alamiah atau
semi sintetis sebab terdiri dari bahan alamiah yang ditambah dengan senyawa
kimia. Berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat karena
mengandung agar yang memadatkan medium; berdasarkan kegunaannya
merupakan medium untuk pertumbuhan jamur. Medium PDA terdiridari
kentang yang berfungsi sebagai sumber energi, nitrogen organik, karbon dan
vitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai bahan pemadat
mediumdan aquadest sebagai pelarut untuk menghomogenkan medium.
Mengapa diperlukan membuat bahan semi alamiah? Karena bahan sintetis
harganya relative mahal, untuk mengurangi penggunaan media sintesis, maka
kita perlu mengetahui pembuatan media alami jika sewaktu waktu memerlukan
media.
 KESIMPULAN

1. Sebelum, sesudah, dan ketika sedang melakukan praktikum, harus dikerjakan

secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi
2. Alat dan bahan yang akan digunakan untuk praktikum, harus disterilisasi
terlebih dahulu agar tidak ada mikroorganisme yang tidak diinginkan,
sehingga mendapatkan hasil penelitian yang baik.
3. Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan atau nutrisi
4. Media diperlukan untuk perkembang biakan mikroba
5. Pembuatan media secara alami dapat mengurangi penggunaan media sintetis
yang harganya mahal
 DAFTAR PUSTAKA
Machmud, M. (1994). Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba . Bogor: BPBTP.

Pelczar, C. (2007). Elements of Microbiology . New York : Mc Graw Hill Book Company .

Rachmawati. (2008). Perbandingan Angka Kuman Pada Cuci Tangan Dengan Beberapa Bahan Sebagai
Standarisasi Kerja, di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam
Indonesia. Penelitian dan Pengabdian, 23-24.

Schlegel, H. G. (1994). Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Syamsunir, A. (1992). Dasar - Dasar Mikrobologi dan Parasitologi untuk Perawatan . Jakarta: Buku
Kedokteran EGC .