Pembuatan Media

Pertumbuhan
Mikrobiologi
Oleh Tohir
Pembuatan Media Pertumbuhan Mikrobiologi – Secara umum, Media yang banyak
dan sering di pake dalam laboratorium Mikrobiologi adalah NA, NB dan PDA. Berikut
Cara Membuat Media Nutrient Agar (NA), Nutrien Broth (NB) dan Potato Dextrose Agar
(PDA).
Media pertumbuhan mikroba sangat beragam. Secara umum dikenal adanya media
pertumbuhan alami dan sintetik. Media alami yaitu bahan dasar media berasal dari
bahan-bahan alami sehingga komposisi nutrien yang dikandungan tidak diketahui pasti
kecuali melalui suatu analisa media AgarTomato. Adapun media sintetik yaitu media yang
komposisi bahannya diketahui pasti sebagai contoh yaitu Nutrient Agar. Diantara
keduanya adapula yang dikenal sebagai media semi sintetik karena sebagian bahannya
berupa bahan alami dan lainnya bahan yang jelas komposisinya sebagai contoh yaitu
Potato Dextrose Agar.

Selain didasarkan komposisi, media pertumbuhan mikroba juga dapat digolongkan

berdasarkan kegunaannya, contoh media kultivasi, media selektif, media diferensial.
Media kultivasi adalah media umum yang digunakan untuk memelihara kultur mikroba
murni, contoh Potato Dextrose Agar untuk fungus dan Nutrient Agar untuk bakteri,. Media
selektif adalah media yang digunakan untuk menseleksi mikroba tertentu yang
diinginkan, bisa menggunakan media khusus atau media kultivasi yang ditambah dengan
senyawa tertentu, contoh yaitu penggunaan media deMann Rugose Agar untuk media
selektif bagi Bakteri Asam Laktat, Nutrient Agar dengan penambahan Nalidixic Acid,
ditujukan agar bakteri Gram positif saja yang tumbuh.

Adapun yang dimaksud media diferensial yaitu media yang dapat digunakan untuk
membedakan jenis mikroba satu dari yang lainnya dari kelompok-kelompok mikroba yang
memiliki kekerabatan dekat dan ciri-ciri dengan kemiripan tinggi. Sebagai contoh adalah
media Endo Agar, pada media ini maka Enterobacteriaceae yang memfermentasi laktosa
akan memiliki koloni berwarna merah, sedangkan yang tidak memfermentasi laktosa
akan menunjukkan koloni yang tidak berwarna.

Baca Juga : Pengenalan Alat Dan Teknik Laboratorium Mikrobiologi

Bahan dan Alat

Bahan dan alat yang digunakan antara lain:

 Beef ekstrak
 Pepton
 Dextrosa
 Kentang
 Agar
 Akuades
 Alat-alat gelas: beaker glass, erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri
 Mikropipet
 Inkubator
 Otoklaf
 pH meter atau pH indikator

1. Pembuatan Nutrient Agar

Timbang bahan dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan
sesuai dengan komposisi berikut:

Beef extract 3 g

Peptone 5 g
Agar 20 g
Akuades s.d 1000 ml

 Larutkan agar pada sebagian air tersebut dan dipanaskan sambil diaduk
(menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer).
 Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef
extract, cukup dengan pengadukan.
 Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai
homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator.
Nilai pH diatur sekitar 6,8-7,2 jika diperlukan dapat ditambahkan HCl jika basa
atau NaOH jika media terlalu asam.
 Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan
autoklaf.
 Jika diinginkan media tegak atau miring, media diisikan ke tabung reaksi
kemudian disterilisasi.
 Saat diperlukan untuk pengisian petridish, media yang sudah disteril dituang ke
cawan petri steril secara aseptis dalam keadaan masih cair dan suhu sekitar
45°C.

2. Pembuatan Nutrient Broth

Untuk Pembuatan NB, Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak
memakai agar.

3. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)

Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang
diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:

Potato / kentang 200 g

Dextrosa 20 g

Agar 20 g

Akuades s.d 1000 ml

  Sebelum ditimbang, kentang dikupas dan diiris kecil-kecil. Rebus kentang
dengan akuades sampai mendidih, selanjutnya disaring. Cairan ditampung di
beaker glass.
 Ekstrak kentang kembali direbus, masukkan agar dan direbus sampai semua
agar larut. Selanjutnya dekstrosa dimasukkan sambil terus diaduk. Penyusutan
volume cairan diganti dengan akuades sampai kembali ke 1000ml.
 Biarkan media sampai agak dingin (± 55C°), diatur media agar memenuhi pH 5-6
menggunakan HCl jika basa atau NaOH jika media terlalu asam.
 Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi, siap disterilisasi.

Sterilisasi merupakan pembebasan semua organisme-organisme yang hidup,termasuk bakteri dan

sporanya,secara kimia atau secara fisika. Fungsi dari sterilisasi ini yaitu agar bakteri-bakteri yang berada
pada alat-alat yang diunakan sebagai praktikum tersebut dapat steril dan tidak terkontaminasi
organisme mikro lainnya dari luar. Terdapat 3 cara untuk melakukan sterilisasi ini yaitu mekanik, fisik
dan kimiawi. Dalam praktikum ini akan dijabarkan mengenai cara fisik yaitu dengan Uap air panas
bertekanan dan menngunakan alat khusus yaitu Autoklaf. Pada umunya, sterilisasi digolongkan menjadi
2 proses yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Dan pada autoklaf termasuk dalam pengoperasian
sterilisasi basah dimana pada proses sterilisasinya memerlikan air. Tekanan yang digunakan pada
autoklaf ini umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang
bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch).
Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. Alasan digunakan suhu 1210C atau
249,80F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0
psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk
autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh
pada suhu 1210C.

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan
di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat
membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992).

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam
mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi
atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan
benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan
biasanya 15 menit untuk 121oC. (Blacksweetranger,2008)

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi :
 1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron
atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk
sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

• Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum
inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat
yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat
menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf.

• Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba
yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. (Indra,
2008)

Adapun fungsi dari dilakukannya steriliasi tersebut ialah :

· Agar terjamin kebersihan alat

· Menyiapkan peralatan dalam keadaan siap pakai

· Mncegah peralatan ceptat rusak

· Mencegah terjadinya infeksi silang

· Sebagai penetapan akhir alat tersebut telah siap pakai

(Anonim,2011)

C. MATERI DAN METODE

Praktikum ini dilakukan pada pukul 15.30 WIB di Laboratorium Budidaya Perairan Fakultas Pertanian
Universitas Lampung pada tanggal 28 Oktober 2012. Alat dan bahan yang digunakan untuk praktikum ini
adalah cawan petri, karet gelang, plastik anti panas, alumunium oil, autoklaf, dan kertas buram.

Adapun prosedur kerja praktikum ini sebagai berikut :

1. Sterilisasi Basah

a. Bungkus cawan petri dengan kertas buram lalu masukkan kedalam plastik tahan panas.

b. Ikat plastik dengan karet, usahakan mengikat dengan kencang agar air tidak masuk kedalam plastik.

c. Sebelum melakukan sterilisasi, periksa banyaknya air dalam autoklaf.

d. Masukkan alat/bahan yang akan disterilkan lalu tutup dan kencangkan sekrup pengaman.

e. Nyalakan api dan biarkan katup uap terbuka sampai semua udara dalam autoklaf diganti dengan
uap. Kemudian tutup katup uap.

f. Proses sterilisasi dimulai setelah suhu meningkat hingga 121⁰ C dan tekanan 1 atm atau 15 lbs
selama 15-20 menit.

g. Matikan api dan biarkan tekanan turun sampai titik 0. Jangan membuka autoklaf sebelum tekanan
sampai pada titik 0 karena cairan dapat tumpah atau alat-alat gelas dapat pecah.

h. Buka tutup autoklaf, lalu ambil alat.

2. Sterilisasi Kering

a. Bungkus alat/bahan yang akan disterilisasi dengan kertas layang-layang

b. Masukkan alat/bahan yng akan disterilkan ke dalam oven

c. Sterilisasi dilakukan pada uhu 200⁰C selama 2 jam.

· Metode yang dilakukan untuk menyeterilkan alat-alat tersebut ialah dengan metode Uap air panas
bertekanan. Dalam metode ini, alat yang digunakan yaitu autoklaf. Berikut adalah cara kerja alat ini :

Cara menggunakan autoclave:

ü Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas
yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk
menghindari terbentuknya kerak dan karat.

ü Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus
dikendorkan.

ü Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari
bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.

ü Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.

ü Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak
keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai
selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.
ü Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga
sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol).
Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

· Adapun fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum steriliasi ini ialah :

ü Cawan petri yaitu wadah yang menyerupai mangkuk dengan dasar rata. Cawan ini digunakan sebagai
wadah penyimpanan dan pembuatan kultur media. Cara penggunaannya yaitu, medium diletakkan di
dalam cawan petri kemudian ditutup dengan menggunakan penutup cawan

ü Autoklaf yaitu alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan. Alat ini terdiri dari
bejana tekanan tinggi yang dilengkapi manometer dan klep bahaya. Otoklaf dipakai untuk sterilisasi
medium atau larutan atau alat-alat yang tidak tahan suhu tinggi. Prinsip kerjanya yaitu mensterilkan
dengan bantuan uap.

ü Kertas buram berfungsi sebagai pembungkus dari media yang akan disterilisasi.

ü Plastik anti panas berfungsi sebagai pembungku dati alat-alat yang akan disterilisasi dan yang telah
terbungkus oleh kertas buram.

ü Karet gelang berfungsi sebagai pengikat plastik yang diikatkan dengan kencang sehingga tidak ada
bakteri yang masuk kedalam alat yang disterillisasi tersebut.

ü Alumunium foil berfungsi sebagai pelapis dari karet gelang agar tidak ada penguapan pada ikatan
yang dibentuk oleh karet gelang tersebut.

· Sterilisasi menggunakan autoklaf membutuhkan waktu yang lebih singkat, sekitar 15 -20 menit.
Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan
yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan
media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan
suhu 1210C atau 249,80F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi.
Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C,
sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air
akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium
terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf
diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu
1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang
terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan
uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai
tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dantimer mulai menghitung waktu
mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan.

Berikut adalah kekurangan dan kelebihan dari sterilisasi basah dan sterilisasi kering :

Sterilisasi basah, kelebihannya : paling efektif,waktu sterilisasi lebih pendek daripada panas kering atau
siklus kimia. Sedangkan kekurangannya : membutuhkan sumber panas yang terus-menerus,
membutuhkan peralatan yang butuh perawatan serius, bahan plastik tidak tahan suhutinggi. Dan pada
sterilisasi kering memiliki kelebihan : murah, tidak terlalu bayak mengontrol dan kekurangannya ialah
membutuhkan listrik terus-menerus, kurang efektif di daerah terpencil,digunakan pada benda-benda
gelas atau logam,karena akan melelehkan bahan lainnya.

Isolasi mikroba membutuhkan media untuk pembiakan organism. Pada medium yang mengandung
pepton dan ekstrak daging. Dalam isolasi udara, media yang biasa digunakan adalah media PDA
dan media NA. media dapat dianggap sebagai kumpulan zat organik maupum zat anorganik yang
digunakan untuk menumbuhkan bakteri maupun jamur dengan syarat-syarat tertentu, seperti
tingkat keasaman, pH, suhu dan sterilisasi.

III. CARA KERJA

Bahan Dasar Medium PDA dan NA yang telah dibuat pada praktikum sebelunya digunakan untuk
medium isolasi.Medium dituangkan ke petridish, dibiarkan mengeras dalam beberapa menit.
Selanjutnya petridish dibiarkan terbuka dibeberapa tempat yaitu laboratorium, luar ruangan, dekat
tong sampah dan di toilet. Biarkan lebih kurang 10 menit, kemudian
petridish ditutup menggunakan kertas kemudian dilakukan sterilisai. Petridish yang telah
adadiinkubasi selama 3 hari atau Selama 48 jam. Setelah 3 hari petridish diamati dan hitung jumlah
koloni yang terbentuk.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, praktikan mendapatkan data jumlah koloni, warna,

dan bentuk koloni dari beberapa tempat, yaitu laboratorium, luar ruangan, di toilet dan dekat

tong sampah. Berikut adalah tabel yang menyajika data tentang mikroba udara.

No Lokasi Medium NA 1 Medium NA 2

Dekat tong sa Jumlah koloni : 24 Jumlah koloni : tidak
mpah ( kel. 7 ) Warna : putih susu dapat dihitung
1.
mengkilat Warna : putih susu
 Bentuk : bulat dan tidak
beraturan

Jumlah koloni : 1
Jumlah koloni : 35 Warna : putih susu
Warna : putih susu Bentuk : bulat
Bentuk : bulat
Dekat tong sampah ( kel. 8 )

Luar ruangan ( kel. 3 ) Gagal Jumlah koloni : 50

Warna : putih
Bentuk : bulat

2.
Jumlah koloni : 11 Jumlah koloni : 5
Luar ruangan ( kel. 4 )
Warna : cream Warna : cream
Bentuk : bulat Bentuk : bulat

Toilet ( kel. 5 ) Jumlah koloni : 53 Jumlah koloni : 14

Warna : cream Warna : cream
mengkilat mengkilat
Bentuk : bulat dan tidak Bentuk : bulat
3.
beraturan

Toilet ( kel. 6 )
Jumlah koloni : 16
 Warna : putih susu Jumlah koloni : tidak
Bentuk : bulat dapat dihitung
Warna : putih susu

Laboratorium ( kel. 2 ) Jumlah koloni : 24 Jumlah koloni : 6

Warna : putih susu Warna : putih susu
Bentuk : bulat Bentuk : bulat
4.

Mikroorganisme tidak dapat diamati langsung dengan mata telanjang. Untuk melihat organisme
dengan ukuran mikroskopis digunakan mikroskop untuk melihat mikroba tersebut. Untuk
mendapatkan miikroorganisme dilakukan isolasi mikroba di udara. Isolasi udara adalah suatu
teknik pemisahan mikroba dengan mengunakan suatu medium/media yang dimana bertujuan
untuk mengamati mikroba dengan jelas dalam populasi yang kecil.
Dalam isolasi udara, media yang biasa di gunakan adalah media PDA dan Media
NA. Medium dapat dianggap sebagai kumpulan zat organik, maupun zat anorganik yang
digunakan untuk menumbuhkan bakteri atau jamur dengan syarat-syarat tertentu,
seperti derajat keasaman (pH), suhu, dan sterilisasi.
Pada praktikum isolasi mikroba udara dilakukan pada 4 tempat berbeda, yaitu luar ruangan,
toilet, laboratorium dan tong sampah. Setelah media di inkubasi selama 3 hari hasil dapat dilihat
pada tabel. Pada praktikum kali ini koloni bakteri lebih banyak didapatkan ditoilet dengan jumlah
koloni 53, kami mendapatkan di toilet lebih banyak didapatkan koloni bakteri daripada di tempat
lain. Koloni yang paling sedikit didapatkan yaitu pada tong sampah dengan jumlah 1 koloni, tong
 sampah didapatkan paling sedikit mungkin dikarenakan adanya faktor waktu yang sebentar pada
saat islolasi atau tidak sesuai dengan prosedur yang dilakukan.

V. KESIMPULAN
Mikroba yang paling banyak terdapat di udara adalah bakteri, di karenakan bakteri lebih cepat

dan mudah berkembang biak dimana saja. Faktor yang mempengaruhi kehidupan bakteri yaitu

faktor lingkungan seperti PH, Suhu dan Keadaan medium. Pada praktikum ini didapatkan koloni

terbanyak di toilet dan paling sedikit di tong sampah.

Abstract
Mikroorganisme seperti bakteri dan kapang maupun khamir hidup di sekitar kita, seperti di
udara, air, tanah, makanan atau pada feses. Mikroorganisme sangat penting untuk diketahui
keuntungannya. Pengamatan ini bertujuan untuk mengamati keanekaragaman mikroorganisme
pada bahan lingkungan berupa udara, mengetahui aktivitas biokimia pada mikroorganisme
sehingga dapat diketahui sifat-sifat yang khas dari mikroorganisme dan pengaruh faktor
lingkungan terhadap kultivasi mikroorganisme. Langkah pertama untuk mengisolasi
mikroorganisme pada lingkungannya dilakukan dengan menggunakan medium Potato Dextrose
Agar (PDA) untuk mengisolasi kapang dan khamir, dan medium Nutrient Agar (NA) untuk media
isolasi bakteri. Setiap bakteri memiliki sifat khas untuk merespon reaksi kimia dengan melakukan
uji biokimia dan pengaruh faktor lingkungan terhadap kultivasi mikroorganisme. Hasil
menunjukkan bahwa bakteri yang telah teridentifikasi merupakan bakteri dari Genus Micrococcus
spp., Streptococcus spp., Escherichia coli, Enterococcus sp. dan Bacillus sp.

Kata kunci : Bakteri, Potato Dextrose Agar, Kapang, Uji biokimia, Isolasi,

1. Pendahuluan

Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang berukuran sangat kecil yaitu dalam skala
micrometer atau micron (μ). Untuk mempelajarinya diperlukan cara tertentu yaitu observasi
mikroskopik dan biakan atau pure culture. Termasuk dalam golongan mikroorganisme adalah
bakteri (Eubacteria,Archaebacteria), fungi (kapang, dan khamir), protozoa, alga dan virus serta
beberapa macam cacing (helmints). Ilmu yang mempelajari mikroorganisme disebut
mikrobiologi (Firmansyah, 2013).
 Mikroorganisme terdapat di berbagai lingkungan yaitu di air, udara, tanah, bahkan di dalam
tubuh organisme hidup lain seperti tumbuhan, hewan, dan manusia di lingkungan alaminya
mikroorganisme jarang terdapat sebagai biakan murni tetapi hidup bersama dengan berbagai
kelompok atau spesies mikroorganisme lain. Teknik-teknik untuk memperoleh biakan murni dari
organisme dalam hal keperluan identifikasi spesies mikroba dilakukan dengan isolasi
mikroorganisme. Isolasi mikroorganisme dari lingkungan dapat dilakukan dengan cara
menumbuhkan pada media NA (Nutrient Agar) untuk medium bakteri, serta PDA (Potato Dextrose
Agar) untuk medium kapang atau khamir (Firmansyah, 2013).
Mikroorganisme memerlukan energi untuk kelangsungan hidupnya. Energi ini dapat
diperoleh dari lingkungan sekitarnya dalam bentuk senyawa kimia tertentu yang dapat diuraikan.
Kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan senyawa tertentu dan mensintesis senyawa yang
baru merupakan sifat khas masing-masing mikroorganisme. Semua aktivitas metabolisme tersebut
berlangsung dengan bantuan dengan enzim tertentu. Hasil reaksi metabolisme ini hampir
semuanya dapa diamati bahkan dapt diukur kekuatannya. Reaksi metabolisme ini berbeda untuk
setiap mikroorganisme, sehingga hal ini merupakan sifat yang sangat penting untuk
mengidentifikasi mikroorganisme (Rahayu, 2015).
Pertumbuhan mikroba pada umumnya sangat tergantung dan dipengaruhi oleh faktor
lingkungan, perubahan faktor lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan
fisiologi. Hal ini dikarenakan, mikroba selain menyediakan nutrient yang sesuai untuk
kultivasinya, juga diperlukan faktor lingkungan yang memungkinkan pertumbuhan mikroba secara
optimum. Mikroba tidak hanya bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi menunjukkan
respon yang menunjukkan respon yang berbeda-beda. Untuk berhasilnya kultivasi berbagai tipe
mikroba diperlukan suatu kombinasi nutrient serta faktor lingkungan yang sesuai (Pelczar, 1986).
Kehidupan bakteri tidak hanya dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan, akan tetapi juga
mempengaruhi keadaan lingkungan. Bakteri dapat mengubah pH dari medium
tempat bakteri hidup, perubahan ini disebut perubahan secara kimia. Adapun faktor-faktor
lingkungan dapat dibagi atas faktor-faktor biotik dan faktor-faktor abiotik. Faktor-faktor biotik
terdiri atas makhluk-makhluk hidup. Sedangkan faktor-faktor abiotik terdiri atas faktor fisika
(misal: suhu, atmosfer gas, pH, tekanan osmotik, kelembaban, sinar gelombang dan pengeringan)
serta faktor kimia (misal: adanya senyawa toksik atau senyawa kimia lainnya (Hadioetomo, 1993).
Medium harus mempunyai pH yang tepat, yaitu tidak terlalu asam atau basa. Kebanyakan bakteri
tidak tumbuh dalam kondisi terlalu basa, dengan pengecualian basil kolera (Vibrio cholerae). Pada dasarnya
tak satupun yang dapat tumbuh baik pada pH lebih dari 8. Kebanyakan patogen, tumbuh paling baik pada
pH netral (pH7) atau pH yang sedikit basa (pH 7,4). Beberapa bakteri tumbuh pada pH 6;tidak jarang
dijumpai organisme yang tumbuh baik pada pH 4 atau 5. Sangat jarang suatu organisme dapat bertahan
dengan baik pada pH 4, bakteri autotrof tertentu merupakan pengecualian, dikarenakan banyak bakteri
menghasilkan produk metabolisme yang bersifat asam atau basa (Volk,1993).
Selain bakteri, kapang dan khamir juga termasuk kedalam mikroorganisme. Kapang dan
khamir merupakan kelompok mikroorganisme yang termasuk filum Fungi. Kehadiran
 mikroorganisme di lingkungan dapat bersifat menguntungkan, karena kemampuannya dalam
merombak senyawa organik komplek menjadi senyawa sederhana yang sangat dibutuhkan
tanaman sebagai sumber nutriennya. Fungsi lain dari fungi adalah menghasilkan berbagai jenis
enzim, vitamin, hormon tumbuh, asam-asam organik dan antibiotik. Sementara itu dari segi
merugikan, kehadiran fungi ini dapat menimbulkan berbagai jenis penyakit yang membahayakan
bagi organisme lain terutama manusia (Noverita, 2009).
Mikroorganisme terdapat disekitar kita, seperti di udara, tanah maupun air. Oleh karena itu
untuk mengetahui keanekaragamannya dilakukan isolasi mikroorganisme dari udara, serta
dilakukan pengamatan uji aktivitas biokimia yaitu uji hidrolisis lemak, polisakarida, dan protein,
uji indol, uji produksi H2S, uji Methyl Red (MR) , uji Voges-Proskauer (VP), uji asetat, uji katalase
dan uji Oksidasi dan Fermentasi (OF) serta dilakukan pengaruh faktor lingkunganberupa uji
pengaruh tekanan osmotik, dan pengaruh pH terhadap kultivasi mikroorganisme untuk
mengidentifikasi jenis dari suatu mikroorganisme seperti bakteri dan kapang pada pengamatan ini.
Pengamatan ini akan mengidentifikasi bakteri dan kapang. Identifikasi genus dari suatu
bakteri memerlukan karakter-karakter utama dari bakteri yaitu morfologi sel (bentuk sel dan
susunan sel), uji biokimia dan uji pengaruh faktor lingkungan terhadap kultivasi mikroorganisme.

2. Metodologi
Alat yang digunakan pada praktikum isoloasi mikroorganisme dari udara antara lain
cawan petri , pipet tetes, rak tabung reaksi, inkubator, jarum ose, pembakar bunsen, Laminar Air
Flow (LAF), pinset, tabung reaksi, penangas air, gelas objek, autoklaf, dan cover glass.
Bahan yang digunakan pada praktikum isolasi mikroorganisme dari udara antara lain
biakan bakteri uji hasil isolasi mikroorganisme, alkohol 70%, spiritus, minyak emersi, NaCL 0,5%,
NaCL 5%, NaCL 10%, NaCL 15%, Glukosa 0,5%, Glukosa 5%, Glukosa 10%, Glukosa 15%,
media Malt Extract Agar(MEA), medium Nutrient Agar (NA), medium Potato Dextrose
Agar (PDA), Paraffin Oil, larutan H202 3% , medium Kligler Iron Agar (KIA), medium cair
Triptopan 1%, reagen Kovac, Larutan Iodine, medium Starch Agar (SA), medium Tributyrin
Agar (TA), Skim Milk Agar (SKM), medium Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP),
medium Simmon Citrate Agar (SCA), medium Hugh & Leifson’s (OF), Metil-Red, Barrit A, Barrit
B dan Alumunium Foil .
Isolasi Mikroorganisme dari Udara
Cawan petri berisi Nutrient Agar (NA) diletakkan dalam keadaan terbuka (tanpa tutup)
selama 5 (lima) menit di Laboratorium Biologi Lantai 4 Pusat Laboratotium Terpadu Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, kemudian cawan petri ditutup kembali, dan
diinkubasi selama 24-48jam.

Pemurnian Bakteri Simbion

 Isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi selanjutnya dimurnikan dengan cara diinokalisikan
dengan ose ke dalam mediumNutrient Agar (NA) untuk bakteri, dan medium Potato Dextrose
Agar (PDA) untuk kapang atau khamir hingga didapat koloni murni yang terpisah.

Pengamatan Morfologi
Pengamatan morfologi koloni bakteri dilakukan dengan melihat warna koloni, bentuk
koloni, bentuk tepi koloni, elevasi (penonjolan), tekstur, dan bentuk sel. Selanjutnya pengamatan
morfologi kapang atau khamir dilakukan dengan melihat warna koloni, ada atau tidaknya hifa.

Uji Aktivitas Biokimia dari Mikroorganisme

a. Uji Hidrolisis Polisakarida, Protein, dan Lemak
Diinokulasi biakan bakteri hasil isolasi kedalam tiga tabung berisi medium Starch Agar (SA) untuk
uji polisakarida, medium Skim Milk Agar (SKM) untuk uji protein, medium Tributyrin Agar (TA)
untuk uji lemak, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30oC-35oC selama 48 jam. Ditambahkan larutan
iodine pada tabung berisi medium Starch Agar (SA) dan biakan bakteri hasil isolasi untuk uji
polisakarida, kemudian diamati zona bening pada ketiga tabung.

b. Uji Produksi H2S

Bakteri diinokulasikan ke dalam 1 (satu) buah tabung yang berisi media tegak Kliger Iron Agar
(KIA). Diinokulasikan dengan cara digoreskan kemudian ditusukkan dengan Jarum Ose Lurus,
selanjutnya diinkubasikan selama 7 (tujuh) hari dalam suhu 30 oC - 35 oC. Diperhatikan munculnya
warna kekuningan diatas permukaan medium dan dipermukaan bawah medium berwarna
hitam mendadakan hasil yang positif.

c. Uji Produksi Indol

Bakteri diinokulasikan ke dalam 1( satu) buah tabung reaksi berisi Triptopan 1%. Diinkubasikan
selama 2 (dua) hari pada suhu 30 oC - 35 oC. Ditambahkan 1 mL reagen Kovac ke dalam setiap
tabung dan dikocok perlahan agar reagen terkumpul di permukaan. Terbentuknya Indol ditandai
dengan adanya cincin warna merah pada permukaan medium.

d. Uji Methyl Red-Voges Proskauer (MR- VP)

Bakteri diinokulasikan ke dalam medium Methyl Red (MR) dan dinkubasikan selama 48 jam
dalam suhu 30 oC, kemudian ditambahkan 5 (lima) tetes Metil-Red. Untuk uji Voges Proskauer
(VP), bakteri diinokulasikan ke dalam medium VP dan diinkubasi selama 48 jam dalam suhu
30 oC, kemudian ditambahkan 15 tetes Barrit A dan Barrit B. Hasil positif ditunjukkan dengan
adanya warna merah dan negatif berwarna kuning.

e. Uji Oksidasi dan Fermentasi (Uji OF)

 Bakteri diinokulasikan ke dalam 1 (satu) buah seri medium OF, kemudain diinokulasikan dengan
cara ditusukkan menggunakan ose dan ditambahkanParrafin Oil setinggi 1 cm. Diinkubasikan
dalam suhu 37 oC selama 7 hari. hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna hijau kekuningan
pada tabung dan negatif ditunjukkan dengan adanya warna biru.

f. Uji Hidrolisis Asam Sitrat

Bakteri diinokulasikan dengan ose ke dalam medium Simmon Citrate Agar, kemudian
diinokulasikan dengan cara digoreskan dan ditusukkan kedalam medium, selanjutnya
diinkubasikan selama 3 (tiga) hingga 5 (lima) hari. Warna biru menunjukkan reaksi positif dan
warna hijau menunjukkan reaksi negatif.

g. Uji Katalase
Biakan bakteri diambil dari stok kultur bakteri diambill sebanyak satu ose (ose bulat). Kemudian
ditambahkan 2-3 tetes reagen H2O2 pada preparat. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuk
gelembung gas, dan hasil negatif tidak terbentuk gelembung gas.

Uji Pengaruh Lingkungan Terhadap Kultivasi Mikroorganisme

a. Uji Pengaruh Tekanan Osmosa
Dibuat 2 (dua) buah medium NaCl (Natrium Klorida) agar dengan ketentuan berupa : cawan petri
1 berisi 0,5% NaCl, cawan petri 2 berisi 5% NaCl, cawan petri 3 berisi 10% NaCl, dan cawan petri
4 berisi 15% NaCl. Dibuat pula 2 (dua) buah medium Glukosa agar dengan ketentuan berupa :
cawan petri 1 berisi 0,5% Glukosa, cawan petri 2 berisi Glukosa 5%, cawan petri 3 berisi Glukosa
10% dan cawan petri 4 berisi Glukosa 15%. Setelah padat, dibagi agar cawan menjadi 4 (empat)
bagian sama besar dengan spidol. Bakteri dan kapang atau khamir dari stok kultur diinokulasikan
sebanyak satu ose kedalam masing-masing agar cawan, kemudian diinkubasikan selama 2 hari
pada suhu 30oC.

b. Uji Pengaruh pH
Disiapkan 3 (tiga) buah agar cawan yang dibuat dari Malt Extract Agar (MEA) dengan pH
masing-masing yaitu 5, 7 dan 9. Cawan dibagi menjadi 6 (enam) sektor. Pada sektor 1,2,3 bakteri
diinokulasikan dan sektor 4,5,6 kapang diinokulasikan, selanjutnya diinkubasi selama 2 hingga 3
hari pada suhu 37oC.

3. Hasil dan Pembahasan

Tabel 1. Hasil isolasi bakteri di Laboratorium Biologi, Pusat Laboratorium Terpadu, UIN Jakarta
Kelompok Lokasi Morfologi Bentuk Diameter
 Nama Koloni
Warna Bentuk Tepi Elevasi Tekstur Sel
Bakteri (cm)
1 Laboratorium Sp.1 Kuning Irregular Lobate Umbonate Kasar Coccus 0,5

Mikrobiologi Sp.2 Kuning Circular Entire Convex Licin Coccus 0,2

2 Laboratorium Sp.1 Kuning Circular Entire Convex Licin Coccus 0,2

Fisiologi Sp.2 Putih Irregular Lobate Umbonate Licin Basil 1,4

3 Laboratorium Sp.1 Putih Circular Undulate Raised Licin Basil 0,2

Biologi Dasar (tidak ditemukan)

4 Laboratorium Sp.1 Kuning Circular Entire Convex Halus Coccus 0,8

Ekologi Dasar Sp.2 Putih Circular Entire Flat Halus Basil 0,2
Lobby Lantai
Sp.1 Kuning Circular Entire Convex Halus Coccus 0,4
5 4
PLT Sp.2 Putih Irregular Undulate Flat Halus Coccus 0,2
Mushalla
Sp.1 Putih Irregular Undulate Umbonate Kasar Coccus 0,1
6 Lantai 4
PLT Sp.2 Putih Circular Entire Raised Kasar Basil 0,4

Identifikasi dilakukan untuk mengetahui spesies bakteri wild tipe yang diperoleh untuk
selanjutnya digunakan untuk berbagai keperluan. Selain itu, proses tersebut juga berfungsi untuk
mengecek ulang (uji konfirmasi) isolat yang telah diketahui spesies dan karakternya, sehingga
dapat
memperkecil kesalahan pada hasil uji yang dilakukan. Identifikasi dan klasifikasi mikroorganisme
haruslah diketahui terlebih dahulu karakteristik atau ciri-ciri mikroorganisme (Mulyati 2013).
Dengan kata lain, setiap kemungkinan dapat terjadi. Dengan melakukan

pendekatan secara konvensional mau pun modern, kita dapat memastikan spesies yang didapatkan.
Proses identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat
biokimia, morfologi koloni, dan morfologi selnya. Pengamatan dan pencatatan ciri morfologi serta
ciri lainnya merupakan tahap pendahuluan yang penting sebelum identifikasi (Mulyati, 2013).
Salah satu tanda suatu kultur dapat dikatakan murni atau tidak adalah dengan dilihat keragaman
koloni yang ada. Suatu kultur biakkan bakteri dikatakan murni apabila bentuk koloni, warna
koloni, morfologi bakteri, hingga hasil uji biokimianya adalah sama. Namun, pada percobaan ini
tidak diperlukan koreksi apakah kultur yang didapat berupa kultur murni atau tidak.
Teknik isolasi dengan membiarkan media terbuka di udara bebas memungkinkan bakteri
dan kapang menempel pada media tersebut. Dari sekian banyak koloni bakteri dan kapang yang
menempel, dipilih 2 (dua) jenis koloni yang berukuran paling besar dan 1 (jenis) untuk kapang
dengan tingkat pertumbuhan terbesar pada media, sehingga didapatkan 11 (sebelas) koloni bakteri
dan 5 (lima) jenis kapang dan 1 (satu) jenis khamir yang masuk ke tahap identifikasi spesies.
 Berdasarkan data yang didapat, diketahui bahwa warna-warna koloni yang muncul hanya
dua, yaitu kuning dan putih. Untuk koloni berwarna kuning, bakteri yang dimungkinkan berasal
dari genus Aeromonas sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Micrococcus sp., Streptococcus sp.
dan Neisseria sp., sedangkan untuk koloni berwarna putih, bakteri yang dimungkinkan berasal dari
genus Escherichia sp., Acinetobacter sp., Staphylococcus sp. danPlesiomonas sp.
(repository.usu.ac.id). Untuk kapang, kemungkinan terbesar berasal dari genus Aspergillus sp.
dan Rhizopus sp. dengan ciri-ciri berupa hifa yang berwarna kuning kecoklatan hingga hitam
(Firmansyah, 2013) dan untuk khamir masih cukup sulit untuk mencari dugaan terkuat mengenai
genus khamir tersebut. Namun, untuk mengetahui lebih lanjut hingga tingkat spesies diperlukan
uji lainnya. Salah satu uji tersebut adalah uji biokimia pada bakteri.

Tabel 2. Data hasil uji biokimia pada bakteri

Hasil Uji
Nama
Mikroba Asam H2S
Polisakarida Protein Lemak Indol MR VP OF Katalase
Sitrat
Warna Retakan
Kuning
Sp. 1 Positif Kontam Positif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Positif Ada
kehitaman
Sp. 2 Positif Kontam Positif Negatif Negatif Negatif Negatif Positif Negatif Kuning Tidak
Tidak
Sp. 1 Positif Positif Negatif Positif Negatif Negatif Negatif Negatif Kuning Tidak
Tumbuh
Tidak
Sp. 1 Positif Positif Negatif Positif Positif Negatif Positif Negatif Kuning Ada
Tumbuh
Tidak
Sp. 1 Positif Positif Negatif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Kuning Ada
Tumbuh
Tidak
Sp. 1 Positif Positif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Positif Kuning Tidak
Tumbuh

Setiap mikroorganisme memiliki sifat yang khas dalam menguraikan suatu senyawa
menjadi senyawa yang baru. Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang
dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi
melalui sifat-sifat fisiologinya (Pelczar, 1986).
Uji fisiologis merupakan tahapan lanjutan yang diperlukan untuk mengidentifikasi suatu
bakteri (Darmayasa, 2008). Dilakukan serangkaian uji seperti uji katalase, uji hidrolisis lemak,
polisakarida dan protein, uji fermentasi karbohidrat, uji produksi indol, uji produksi H2S, uji MR-
VP dan uji OF. Uji Katalase bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguari
Hidrogen peroksida (H2O2) (Yulvizar, 2013). Uji hidrolisis lemak, polisakarida dan protein untuk
mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis dan memanfaatkan molekul lemak, protein
dan polisakarida (Wulandari, 2014). Uji fermentasi karbohidrat dilakukan untuk mengidentifikasi
bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Karboidrat atau gula dapat difermentasikan
menjadi bermacam-macam zat, seperti alkohol, asam, dan gas, tergantung pada macamnya gula
dan spesies bakteri. Terbentuknya asam pada uji ini ditandai dengan berubahnya warna indikator
dalam medium (Ferdiaz, 1992). Uji Indol dikatakan positif ditandai dengan terbentuknya warna
merah pada medium yang menunjukkan bakteri memiliki enzim triptonase yang dapat
menghidrolisis asam amino jenis triptofan yang memiliki gugus samping indol sehingga indol akan
bereaksi dengan reagen uji dan membentuk indol yang berwarna merah (Ferdiaz, 1992). Uji
Produksi H2S untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memecah gugus protein dan
memproduksi H2S. Uji Methyl Red (MR) sendiri digunakan untuk menentukan adanya produk
asam campuran dari fermentasi glukosa melalui jalur fermentasi asam campuran yang umumnya
berupa asam laktat, asam asetat, asam format, dan asam suksinat, sedangkan uji Voges-Proskauer
(VP) digunakan untuk menentukan kemampuan bakteri tersebut untuk menghasilkan produk akhir
yang netral (asetilmetilkarbinol) dari fermentasi glukosa melalui jalur butanediol (Muthmainnah,
2013). Uji Oksidasi Fermentasi akan mendeterminasi bakteri yang bersifat oksidatif dengan yang
bersifat fermentif. Bakteri oksidatif hanya akan menghasilkan produksi asam bila terkena udara
dan tidak atau sedikit sekali menghasilkan produk asam pada kondisi tanpa udara. Sementara,
bakteri fermentif baik tanpa udara atau pun udara akan tetap menghasilkan produk fermentasi
berupa asam.
Dari data yang didapat, setiap bakteri yang diujikan memberikan respon yang berbeda-
beda pada tiap uji biokimia. Artinya, diduga kuat bahwa setiap bakteri yang didapat merupakan
spesies yang berbeda-beda, meskipun dimungkinkan berasal dari genus yang sama. Salah satu uji
yaitu uji katalase dapat membedakan antara genus Staphylococcus dengan Streptococcus.
Kelompok Streptococcus memberikan reaksi negatif, sedangkan Staphylococcusmemberikan
reaksi positif pada uji katalase (Karimela, 2013).

Tabel 3. Hasil pengujian bakteri dan kapang terhadap tekanan osmosis

konsentarsi Glukosa (%) konsentrasi Nacl (%)
Kelompok Mikroorganisme
0,5 5 10 15 0,5 5 10 15
1 Bakteri Sp.1 - + - - + + - -
2 Bakteri Sp. 2 + - + - + - + -
3 Bakteri Sp. 1 + + + + + + - -
4 Bakteri Sp. 1 + + + + + + - -
5 Bakteri Sp. 1 + + + + + + + -
6 Bakteri SP.1 + + + + + + + -
1 Kapang + + - + + + + +
2 Kapang + + + + + + + -
3 Kapang + + + + + + + -
4 Kapang + + + + + + + +
5 Kapang + + + + - + + -
6 Kapang + + + + + + + -
Keterangan : (+) menandakan adanya pertumbuhan
(-)menandakan tidak ada pertumbuhan

Tabel 4. Hasil pengujian bakteri dan kapang tehadap pH.

Ph
Kelompok Mikroorganisme
5 7 9
1 Bakteri ++ +++ +
2 Bakteri ++ +++ +
3 Bakteri ++ +++ +
4 Kapang ++ +++ +
5 kapang ++ +++ +
6 Kapang ++ +++ +

Keterangan: (+++) menunjukkan banyak pertumbuhan

(++) menunjukan pertumbuhan sedang
(+) menunjukkan pertumbuhan yang sedikit

Pertumbuhan pada mikroorganisme dapat diartikan sebagai pertumbuhan jumlah koloni, dalam
pertumbuhan setiap mikroorganisme membutuhkan nutrisi yang mencukupi dari lingkungan hidup yang
mendukung dalam proses pertumbuhan tersebut. Kebutuhan aspek fisik pada lingkungan dapat mencakup
suhu, pH, cahaya, UV, dan tekanan osmosis (Suharjono, 2006). Perubahan faktor lingkungan dapat
mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi. Namun, beberapa kelompok mikroba sangat
resisten terhadap perubahan faktor lingkungan. Jika suatu mikroorganisme mendapatkan nutrien dan
menempati lingkungan yang sama, maka pertumbuhan yang dialami pada mikroorganisme akan optimum.
Berdasarkan pada hasil uji pengaruh faktor lingkungan terhadap kultivasi mikroorganisme telah dilakukan
uji tekanan osmotik dan uji pengaruh pH. Tekanan osmosis sangat erat hubungannya dengan kandungan
air, dan karena adanya perbedaan tekanan osmosis di dalam dan di luar sel yang akan menyebabkan
gangguan pada sistem metabolisme. Medium yang paling cocok bagi kehidupan bakteri maupun
kapang/khamir yaitu medium yang isotonik terhadap isi sel (Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan pada hasil pengamatan dapat dilihat bahwa pada saat konsentrasi glukosa 0,5% semua
bakteri dan kapang mengalami pertumbuhan, kecuali pada bakteri kelompok 1 tidak mengalami
pertumbuhan. Tidak hanya pada konsentrasi glukosa 0,5% yang tidak mengalami pertumbuhan, akan tetapi
pada glukosa 10%, 15%, NaCl 15%. Sedangkan, hanya terjadi pertumbuhan pada glukosa 5%, NaCl 0,5%,
dan NaCl 5%. Sehingga dapat diketahui bahwa bakteri kelompok 1 merupakan bateri yang tidak dapat
beradaptasi terhadap perubahan tekanan osmosis. Kemudian, pada bakteri kelompok 3,4,5, dan 6 pada
kapang/khamir semua kelompok dapat mengalami proses pertumbuhan pada medium glukosa dengan
konsentrasi 15. Hal ini menunjukan bahwa bakteri, kapang/khamir yang mengalami pertumbuhan pada
media tersebut termasuk ke dalam kelompok osmofil. Mikroorganisme osmofil merupakan
mikroorganisme yang dapat tumbuh pada konsentrasi gula yang tinggi (Suharjono, 2006).
Selanjutnya, pada medium NaCl 15% tidak ada yang mengalami pertumbuhan, sedangkan pada
kapang.khamir kelompok 1 dan 4 mengalami pertumbuhan. Hal ini menunjukan bahwa kapang/khamir
yang tumbuh tersebut tergolong dalam kategori golongan halofilik, yang merupakan mikroorganisme yang
dapat tumbuh pada kadar garam halogen yang tinggi, dan dengan konsentrasi yang tinggi tidak mengalami
proses metabolisme bakteri. Bakteri halofilik memiliki membran purple bilayer, dinding sel terdiri dari
murein, sehingga mampu bertahan dengan adanya ion Natrium (Dwidjoseputro, 2005)
Setiap mikroorganisme memiliki pH maksimum, minimum, dan optimum untuk pertumbuhannya.
Berdasarkan pada perbedaan daerah pH untuk pertumbuhannya adalah asidofil untuk mikroorganisme yang
mampu tumbuh pada pH optimum pada pH asam. Alkalofil untuk mikroorganisme yang dapat tumbuh
secara optimum pada daerah pH basa, dan Neutrofil untuk mikroorganisme yang dapat tumbuh secara
optimum pada daerah pH netral (Suharjono, 2006).
Berdasarkan pada hasil uji mengenai faktor lingkungan pH diketahui bahwa hasil pertumbuhan
paling banyak terjadi pada pH yang netral (pH=7) ketika diujikan baik dari bakteri maupun kapanh/khamir.
Hal ini dikarenakan pada keduanya dapat tumbuh secara baik pada kondisi yang tidak terlalu asam dan
tidak terlalu basa. Bila pH lingkungan terlalu asam atau basa maka akan mengakibatkan terhambatnya
aktivasi enzim sehingga mikroorganisme tersebut tidak mampu melakukan proses metabolismenya secara
baik. Pada umumnya, kisaran optimum pertumbuhan mikroorganisme dalam pH adalah 5,5-8,0 atau yang
termasuk ke dalam tipe mesofil (neutrofil). Pertumbuhan tertinggi kedua yaitu pada pH 5 dan biasanya
pertumbuhan ini didominasi oleh kapang/khamir. Berdasarkan pada literatur khamir memiliki pH optimum
pada 4,0-4,5 sedangkan pada jamur pada pH yang lebih luas (Entijang, 2003).

Analisis spesies bakteri

Untuk Sp. 1 pada Kelompok 1 dengan ciri-ciri koloni dengan warna koloni kuning, bentuk
irregular, tepi lobate, elevasi umbonate, tekstur kasar dan dengan bentuk sel berupa kokus, dugaan terkuat
adalah Streptococcus sp.. Meskipun beberapa genus Streptococcus sp. memiliki hasil uji biokimia yang
berbeda, namun secara kesuluruhan cukup mirip. Menurut Rahayu (2015), ciri-ciri
bakteri Streptococcus sp. adalah memiliki bentuk koloni yang halus, membulat, cembung dan transparan
dengan diameter koloni antara 0,5 hingga 1 cm. Hasil uji biokimia juga menunjukkan bahwa
bakteri Streptococcus sp. tidak mampu mengatalisis peroksida (H2O2), tidak menghasilkan indol, namun
mampu menghidrolisis polisakarida. Sebagian Streptococcus sp. memberikan respon yang negatif pada uji
VP, Sitrat dan Indol, namun sebagian memberikan respon positif pada uji MR. Pendalaman dengan uji
molekuler perlu dilakukan untuk lebih mendeterminasi hingga tingkat spesies.
Untuk Sp. 2 pada kelompok 2 dengan ciri-ciri koloni dengan warna koloni putih, bentuk koloni
circular, tepi koloni entire, elevasi koloni convex, tekstur yang licin, bentuk bakteri berupa basil dengan
diameter koloni adalah 1,4 mm. Koloni berwarna putih memiliki indikasi bahwa bakteri tersebut berasal
dari genus Escherichia sp., Acinetobacter sp., dan Staphylococcus sp.. Escherichia coli diduga kuat
karena memiliki ciri-ciri berupa hasil katalase yang positif, bentuk bakteri berupa basil, diameter koloni
berkisar antara 1,1 hingga 1,5 cm, mampu menghidrolisis polisakarida, tidak menghasilkan senyawa indol,
dan negati pada uji MR-VP (repository.usu.ac.id). Dari kriteria bakteri yang berasal dari literatur, semua
kriteria sama dengan hasil uji yang dilakukan, sehingga dapat dikatakan bahwa bakteri pada Sp. 2 kelompok
2 merupakan bakteri Escherichia coli.
Sp. 1 pada kelompok 3 memiliki ciri-ciri berupa warna koloni putih, bentuk koloni circular, tepi
koloni undulate, elevasi koloni raised, tekstur licin, bakteri berbentuk basil dengan diameter koloni sebesar
0,2 cm. Koloni berwarna putih dapat diduga merupakan bakteri dari
genus Escherichia sp.,Acinetobacter sp., Pleisomonas sp. dan Staphylococcus sp.. Bacillus sp. diduga kuat
sebagai bakteri pada koloni ini. Bacillus sp. memiliki ciri-ciri seperti bentuk sel yang basil, diameter koloni
0,1 hingga 0,3 cm, warna koloni putih, menunjukkan hasil negatif pada uji katalase, pembentukan H2S dan
sitrat (repository.usu.ac.id). Bakteri ini diduga bakteri basil yang berbeda karena memiliki warna putih pada
koloninya, yang berlawanan dengan literatur bahwa bakteri berasal dari genus Bacillus sp. Untuk
mengidentifikasi hingga tingkat spesies, diperlukan uji molekuler lebih lanjut.
Sp. 1 pada kelompok 4 memiliki ciri-ciri berupa warna koloni kuning, bentuk circular, tepi entire,
elevasi koloni convex, tekstur halus, bentuk bakteri berupa kokus dengan diameter koloni adalah 0,8 cm.
Koloni berwarna kuning diduga berasal dari
genus Bacillus sp., Streptococcus sp., Micrococcus sp.,Neisseria sp. dan Aeromonas sp.. Micrococcus sp.
diduga kuat karena hasil isolasi menunjukkan bahwa Micrococcus sp. memiliki diameter koloni antara 0,2
hingga 2 cm dan memiliki warna koloni kuning. Uji biokimia dari Micrococcus sp. adalah positif pada uji
katalase, indol, MR-VP dan uji produksi H2S (repository.usu.ac.id).
Sp. 1 pada kelompok 5 memiliki ciri yang sama dengan bakteri pada kelompok 4. Perbedaannya
pada hasil uji Methyl Red (MR) dan diameter koloni. Hasil uji MR menunjukkan negatif, yang artinya
bakteri ini tidak mampu menghasilkan produk fermentasi asam campuran. Kemungkinan besar bahwa
bakteri ini sama dengan bakteri pada kelompok 4 yaitu Micrococcus sp., hanya saja dari spesies yang
berbeda.
Sp. 1 pada kelompok 6 memiliki ciri berupa warna koloni putih, bentuk koloni irreguler, tepi koloni
undulate, elevasi koloni umbonate, tekstur kasar, bentuk sel kokus dan diameter koloni 0,1 cm. Diduga kuat
spesies ini berasal dari genus Enterococcuss sp., meskipun bentuk koloni sama denganStreptococcus sp.
namun bentuk morfologi yang berbeda telah mendeterminasi atau membedakan antara kedua spesies
tersebut

KESIMPULAN
Isolasi mikroorganisme dari lingkungan dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan pada media
NA dalam keadaan terbuka yang menjadi sumber isolasi. Mikroorganisme dapat diketahui aktivitas
biokimianya dengan melakukan berbagai uji diantaranya yaitu uji hidrolisis pati, protein, lemak, uji
produksi indol, uji MR-VP, uji OF, uji katalase, uji asam sitrat dan uji H2S. Mikroorganisme membutuhkan
nutrisi yang mencukupi dari lingkungan hidup yang mendukung dalam proses pertumbuhan tersebut.
Kebutuhan aspek fisik pada lingkungan dapat mencakup suhu, pH, cahaya, UV, dan tekanan osmosis.
Kualitas Air dan Makanan
Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme hidup yang berukuran sangat kecil dan hanya dapat diamati
dengan menggunakan mikroskop. Mikroorganisme dapat berinteraksi dengan organisme lain dengan cara
yang menguntungkan atau merugikan. Interaksi mikroorganisme dengan bahan pangan dapat menyebabkan
perubahan pada bahan pangan tersebut.Perubahan pada bahan pangan tersebut dapat berupa perubahan
menguntungkan atau merugikan. Perubahan yang menguntungkan dapat kita lihat pada proses pembuatan
tempe oleh jamur, pembuatan yoghurt oleh Lactobacillus bulgaricus. Sedangkan perubahan yang merugikan
dapat berupa kerusakan atau pembusukan makanan.
Kerusakan bahan pangan dapat berlangsung cepat atau lambat tergantung dari jenis bahan pangan atau
makanan yang bersangkutan dan kondisi lingkungan dimana bahan pangan tersebut diletakkan (Wijayanti,
2011).Salah satu indikator kerusakan produk pangan atau makanan adalah bila jumlah mikroorganisme
tumbuh melebihi batas yang telah ditetapkan.Untuk mengetahui sejauh mana kerusakan bahan pangan
tersebut dan untuk mengetahui aman atau tidaknya makanan tersebut dikonsumsi, maka harus terlebih
dahulu dilakukan pemeriksaan mikrobiologi.Pengujian mikrobiologi diantaranya meliputi uji kuantitatif
untuk menentukan mutu dan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan
tingkat keamanannya, dan uji bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi makanan tersebut
(Fardiaz, 1993).
Pengujian mikrobiologi pada sampel makanan akan selalu mengacu kepada persyaratan makanan yang sudah
ditetapkan. Parameter uji mikrobiologi pada air dan makanan yang dipersyaratkan sesuai Standar
Nasional Indonesia diantaranya uji TPC (Total Plate Count) atau ALT (Angka Lempeng Total), uji MPN
Coliform dan lain-lain.Uji Total Plate Count (TPC) merupakan metode kuantitatif yang umumnya digunakan
untuk menghitung adanya bakteri secara langsung.
Dengan bekerja secara kelompok, carilah informasi persyaratan standar TPC pada beberapa produk makanan
dan informasi mengenai prosedur analisis TPC.

b. Metode Total Plate Count (TPC)

Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah menumbuhkan sel mikroorganisme
yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini
merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme.Dengan metode ini, kita
dapat menghitung sel yang masih hidup, menentukan jenis mikroba yang tumbuh dalam media tersebut serta
dapat mengisolasi dan mengidentifikasi jenis koloni mikroba tersebut.
Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus dikuasai.Sebelum mikroorganisme
ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu dilakukan pengenceran sampel menggunakan larutan
fisiologis.Tujuan dari pengenceran sampel yaitu mengurangi jumlah kandungan mikroba dalam sampel
sehingga nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah mikroorganisme secara spesifik sehingga didapatkan
perhitungan yang tepat.Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni (Fardiaz, 1993). Menurut
Waluyo (2005), tahapan pengenceran dimulai dari membuat larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1
ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis). Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan
kedalam 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1
ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran
10-3, begitu seterusnya sampai mencapai pengenceran yang kita harapkan.Secara keseluruhan, tahap
pengenceran dijelaskan dalam gambar berikut ini.
Gambar 1. Teknik pengenceran Sampel (Sumber. Pearson, 2006)
Advertisement
Setelah dilakukan pengenceran, kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar.Setelah
diinkubasi, jumlah koloni masing-masing
cawan diamati dan dihitung.Koloni merupakan sekumpulan mikroorganisme yang memiliki kesamaan sifat
seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang
tumbuh di permukaan medium adalah sebagai berikut:

 Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa satu titik, namun ada pula yang melebar sampai
menutup permukaan medium.
 Bentuk. Ada koloni yang bulat dan memanjang. Ada yang tepinya rata dan tidak rata.
 Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata dengan permukaan medium, ada pula yang timbul diatas
permukaan medium.
 Halus kasarnya pemukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang permukaannya kasar dan tidak
rata.
 Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat da nada yang permukaannya suram.
 Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
 Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lender, ada yang keras dan kering.
Selanjutnya perhitungan dilakukan terhadap cawan petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-
300.Perhitungan Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan
faktor pengencer.
Keuntungan dari metode TPC adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya
dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh.Adapun kelemahan dari metode ini
adalah:
 Memungkinkan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang
berpasangan, rantai atau kelompok sel.
 Memungkinkan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis
mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen
selama masa inkubasi.
 Memungkinkan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media,sehingga
menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.
 Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila
jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik,
namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara
koloni.
 Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan
waktu 24 jam atau lebih.
Uji Total Plate Countmenggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara
visual dan dihitung. Sebelum diuji di media padat, sampel terlebih dahulu harus diencerkan. Pengenceran
sampel dilakukan terhadap sediaan yang akan didentifikasi kemudian ditanam pada media lempeng agar.
Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang
sesuai.Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300.Total Plate Count
dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.
Teknik pengenceran sampel dilakukan pada metode cawantuang (pour plate). Pada metode tuang, sejumlah
sampel dari hasil pengenceran sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan
media yang telah disterilkan sebanyak 15-20 ml. Kemudian cawan petri digoyang agar media dan sampel
tercampur rata dan biarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan
media yang kaya oksigen, tetapi ada pula yang tumbuh didalam media yang tidak begitu banyak mengandung
oksigen. Secara keseluruhan tahap dalam metode cawan tuang (pour plate) ini dijelaskan pada gambar
berikut.

Gambar 2. Proses inokulasi bakteri, penuangan media dan penghomogenan larutan

 Sementara pada metode lainnya yaitu metode goresan, proses penanaman bakteri hanya dilakukan di
permukaan bakteri saja.Teknik ini menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan metode ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat
tumbuh, karena goresan hanya dilakukan di permukaan media saja.

Gambar 3. Pertumbuhan bakteri pada metode Spread plate dan Pour plate
Pada gambar diatas dapat anda lihat bahwa pada metode goresan atau spread plate, bakteri hanya tumbuh
pada permkaan media yang digores saja, sementara pada metode cawan tuang atau pour plate, bakteri
tumbuh tidak hanya di permukaan media saja tetapi diseluruh bagian media.
Dalam melakukan teknik goresan harus memperhatikan beberapa hal berikut ini, antara lain:
1. Gunakan jarum ose yang telah dingin untuk menggores permukaan lempengan media. Jarum ose yang
masih panas akan mematikan mikroorganisme sehingga tidak terlihat adanya pertumbuhan
mikroorganisme di bekas goresan.
2. Sewaktu menggores, jarum ose dibiarkan meluncur diatas permukaan lempengan. Media agar yang luka
akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.
3. Jarum ose harus dipijarkan kembali setelah menggores suatu daerah, hal ini dengan tujuan mematikan
mikroorganisme yang melekat pada mata jarum ose dan mencegah kontaminasi pada penggoresan
berikutnya.
4. Menggunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan supaya terhindar dari kontaminasi.
5. Membalikkan lempengan media agar untuk mencegah air kondensasi jatuh diatas pemukaan media.
Ada beberapa teknik penggesekan, yaitu
1. Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar cawan petri.
 Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.
 Panaskan mata jarum ose dan biarkan dingin kembali.
 Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan penggoresan pada daerah II
 Ulangi prosedur diatas untuk melakukan penggoresan untuk daerah III

2. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4
 3. Goresan Radian
 Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
 Pijarkan mata jarum ose dan dinginkan kembali
 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya
4. Goresan Sinambung
 Ambil satu mata ose suspense dan goreskan setengah permukaan lempengan agar
 Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa
permukaan lempengan agar.

c. Perhitungan Koloni Bakteri

Untuk melaporkan analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate Count” yang
menjelaskam cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung
jumlah koloni dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan harus memperhatikan hal-hal berikut
ini :
 Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25 sampai 250.
 Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana
jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.
 Suatu deretan atau rantai koloni yang terlihat seperti suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Count (SPC) harus mengikuti peraturan sebagai
berikut (SNI 01-2897-1992):
1) Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni.
Contoh:
Jumlah koloni rata-rata => Jumlah kedua cawan yang memenuhi syarat dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Perhitungan Total Plate Count adalah:

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 20.000 cfu/ml

2) Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni ≤25 atau ≥250 maka hitunglah jumlah rata-
rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya .
Contoh :

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 22.500 cfu/ml

3) Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 25-
250 => hitunglah jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran, dikalikan dengan faktor
pengencerannya dan rata-rata jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut.
Contoh:
Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 36.000 cfu/ml
4) Bila hasil perhitungan diatas, pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata
≥2 kali jumlah koloni rata-rata pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran yang lebih
rendah.

Contoh:

Maka Total Plate Countadalah 140x102cfu/ml

5) Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Total Plate Countdinyatakan sebagai <1 br=””
dikalikan=”” faktor=”” pengenceran=”” terendah.=””>
Contoh:

6) Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni ≥250, dipilih cawan dari tingkat pengenceran tertinggi
kemudian dibagi menjadi beberapa bagian atau sector (2,4, atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu
sektor
Contoh:

Selanjutnya ,Total Plate Countdidapatkan dari hasil jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian
dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran .
Contoh:

d. Cara Menghitung dan Membulatkan Angka

Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan, yaitu
angka yang pertama dan kedua. Pembulatan angka keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi
angka yang lebih tinggi jika angka ketika adalah 6,7,8,atau 9. Gunakanlah angka 0 pada masing-masing angka
pada digit berikutnya. Pembulatan angka kebawah bila angka ketiga adalah 1,2,3, atau 4. Bila angka ketiga
adalah angka 5, maka bulatkanlah keatas jika angka kedua merupakan bilangan ganjil atau bulatkan kebawah
bila angka kedua merupakan bilangan genap.