1

BAB 3. METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Dasar-dasar Mikrobiologi Akuatik dilaksanakan pada hari Kamis,

12 September sampai 18 Oktober 2019, setiap pukul 14.30 WITA s/d selesai,

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Peternakan dan Perikanan,

Universitas Tadulako, Palu.

3.2 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan selama praktikum dasar-dasar mikrobiologi

akuatik tertera pada Tabel 3-1.

Tabel 3-1. Alat dan bahan yang digunakan

No Nama Alat dan Bahan Kegunaan
Alat

1. Buku Untuk mencatat hasil yang diperoleh

pada saat praktek
2. Pulpen Sebagai alat tulis menulis
3. Camera Untuk mengambil dokumentasi
4. Labu Erlenmeyer Untuk menampung larutan
5. Incubator Untuk mengikubasi
6. Bunsen Untuk memanaskan atau membakar
7. Kaca Preparat Untuk menyimpan obyek
8. Jarum Ose Untuk memindahkan bakteri
9. Autoklaf Untuk alat untuk mensterilkan
10. Oven Untuk mensterilisasi
11. Timbangan Analitik Untuk menimbang
12. Hot Plate Untuk memanaskan
13. Colony Counter Untuk menimbang
14. Cawan Petri Untuk tempat berkembang biakan
materi
15. Pipet Skala Untuk mengambil cairan
16. Rak Tabung Untuk tempat menyimpan tabung
Bahan
17. Air Payau Sebagai air sampel media TSA
 2

18. Air Kolam Sebagai air sampel media NA

19. Bakteri v.harveyi Sebagai sampel
20. TSA Sebagai media penumbuhan bakteri
21. NA Sebagai media penumbuhan bakteri
22. NaCL Sebagai larutan Fisiologis
23. Kristal violet Sebagai pemberi warna ungu
24. Etanol Sebagai pemberi warna Orange
25. Iodium Sebagai pemberi warna
26. Safranin Sebagai pemberi warna merah
27. Aquades Sebagai pembersih alat laboratorium

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pengenalan Alat

Prosedur kerja pada praktikum Dasar-dasar Mikrobiologi Akuatik mengenai

Pengenalan Alat adalah sebagai berikut:

1. Memaikai jas laboratorium saat memesuki laboratorium.

2. Mendengarkan penjelasan dari asisten mengenai peralatan yang digunakan

selama praktikum

3. Mencatat hal-hal yang penting.

4. Mengambil gambar alat-alat yang digunakan.

3.3.2 Sterilisasi Alat

3.3.2.1 Sterilisasi Kering

Prosedur kerja yang dilakukan pada saat praktikum adalah sebagai berikut.

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan disterilisasi.

2. Mensterilkan tangan dan alat yang akan digunakan menggunakan akuades

steril agar tidak terkontaminasi dengan bakteri yang menyebar.

3. Bungkus alat yang akan di sterilisasi menggunakan kertas.

 3

4. Kemudian memasukkan kedalam oven dengan suhu 150o – 170o hingga ( 1-3

jam )

5. Selanjutnya, sterilisasi menggunakan oven dan diamkan alat tersebut sampai

dingin.

6. Kemudian alat yang telah di sterilisasi kering siap untuk digunakan sebagai

tempat meletakkan media agar.

3.3.2.2 Sterilisasi basah

Prosedur kerja yang dilakukan pada saat praktikum adalah sebagai berikut.

1. Menyiapkan bahan yang akan disterilisasi.

2. Cek volume air pastikan sesuai dengan ketentuan.

3. Masukkan larutan media yang akan disterilisasi dan tutup autoclave.

4. Nyalakan autoclave, lalu atur waktunya 15 menit dengan suhu 121o dan

tekanan 15 psi.

5. Selanjutnya, tunggu hingga sterilisasi selesai buka autoclave dan ambil bahan

yang telah anda sterilisasi. siap untuk digunakan sebagai tempat meletakkan

media agar.

3.3.3 Pembuatan Media

3.3.3.1 Pembuatan media Tryptic Soy Agar (TSA)

Prosedur kerja yang dilakukan pada saat praktikum adalah sebagai

berikut.

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

 4

2. Mensterilkan tangan dan alat yang akan digunakan menggunakan akuades

steril agar tidak terkontaminasi dengan bakteri yang menyebar.

3. Menimbang media Tryptic Soy Agar (TSA)

4. Kemudian memasukkan media Tryptic Soy Agar (TSA) ke dalam erlenmeyer

dan menambahkan akuades steril sebanyak±300 ml.

5. Setelah itu, melakukan homogenisasi atau mencampurkan dengan

menggunakan batang pengaduk melalui hot plate.

6. Selanjutnya, sterilisasi menggunakan autoclave dan diamkan media tersebut

sampai dingin.

7. Kemudian menuangkan media Typtic Soy Agar (TSA) ke dalam 4 buah cawan

petri dan mendiamkan sampai mengeras, Dan melebel setiap cawan untuk

lebih memudahkan lalu bungkus menggunakan plastic dan simapn di kulkas.

3.3.3.2 Nutrien Agar

Prosedur kerja yang dilakukan pada saat praktikum adalah sebagai

berikut.

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Mensterilkan tangan dan alat yang akan digunakan menggunakan akuades

steril agar tidak terkontaminasi dengan bakteri yang menyebar.

3. Menimbang media Natrium Agar (NA)

4. Kemudian memasukkan media Natrium Agar (NA) ke dalam erlenmeyer dan

menambahkan akuades steril sebanyak ± 300 ml.

5. Setelah itu, melakukan homogenisasi atau mencampurkan dengan

menggunakan batang pengaduk melalui hot plate.

 5

6. Selanjutnya, sterilisasi menggunakan autoclave dan diamkan media tersebut

sampai dingin.

7. Kemudian menuangkan media Natrium Agar (NA) ke dalam 4 buah cawan

petri dan mendiamkan sampai mengeras, dan melebel setiap cawan untuk

lebih memudahkan lalu bungkus menggunakan plastik dan simapn di kulkas.

3.3.4. Isolasi Bakteri

3.3.4.1 Pengenceran (serial dilution)

Prosedur kerja dalam melakukan pengenceran yaitu:

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Mengambil air sampel sebanyak 1 ml kedalam pengenceran 10−1 yang berisi

aquaes steril 9 ml dan selanjutnya dihomogenkan.

3. Memindahkan sampel sebanyak 1 ml dari pengenceran 10−1 ke pengenceran

10−2 (selanjutnya prosedur inidilakukan sampai ke pengenceran 10−6 ).

3.3.4.2 Metode sebar (spread plate method)

Prosedur kerja dalam melakukan metode tuang yaitu:

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Memindahkan sampel sebanyak 1 ml dari pengenceran 10−2 ke media TSA

10−2 (selanjutnya prosedur ini dilakukan pada media TSA dan NA

10−2 SAMPAI 10−7).

3. Selanjutnya meratakan larutan di media agar TSA dan NA dengan batang L.

4. Memasukan semua media kedalam inkubator selama 48 jam.

5. Menghitung jumlah koloni yang ada pada media TSA dan NA. Menggunakan

colony counter.
 6

3.3.4.3 Metode gores (Streak plate method)

Prosedur kerja dalam melakukan metode gores yaitu :

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Memanaskan jarum ose dan Mendinginkan jarum ose dengan cara diangin-

anginkandan menggoreskan pada media TSA dan NA.

3. Mengambil koloni v.harveyi dari cawing petri.

4. Selanjutnya menyimpan media yang akan digores koloni dan masukkan

kedalam inkobator.

3.3.5. Pewarnaan Garam

Prosedur kerja yang dilakukan dalam praktikum mengenai pewarnaan

gram yaitu seperti berikut :

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan beri tanda lingkaran pada

kaca preparat tetesi dengan air steril sebangan 1-2 tetes.

2. Mengambil bakteri menggunakan jarum ose yang terlebih dahulu dipanaskan,

letakan bakteri dikaca preparat hingga rata seluas daerah lingkaran. Dan

biarkan olesan kering di udara.

3. Lalukan kaca objek di atas api Bunsen. Kaca objek harus terasa agak panas

bila di tempelkan pada punggung tangan.

4. Menggenangi olesan bakteri dengan larutan Kristal violet selama 1 menit, lalu

cuci menggunkan air.

5. Menggenangi lagi dengan larutan iodium selama 2 menit. Buang kelebihan

iodium dan bilas dengan air.

6. Mencuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95% , tetes demi tetes selama 30
detik atau sampai warna ungu hilang. Cuci dengan air kemudian tiriskan.
 7

7. Menggenangi olesan dengan pewarna tandingan yaitu safranin selama 30

detik. Buang sisa larutan safranin lalu bilas dengan air.
8. Memtiriskan kaca obyek dan serap kelebihan air pada olesan dengan menekan

kertas serap dengan hati-hati ke atasnya.

9. Mengamati kaca obyek dibawah mikroskop, apabila warna ungu berarti gram

+ (positif) dan warna merah berarti gram – (negatif).

3.4 Analisa Data

Berdasarkan praktikum dasar-dasar mikrobiologi akuatik analisis data yang

digunakan untuk perhitungan koloni yaitu:

Larutan fisiologis NaCL

NaCL = Natrium klorida

5 gram/L, yamg di butuhkan Cuma 100 ml aquades

5 x 100 = 0,5 gr

1000

Jadi NaCL yang dibutuhkan 0,5 gr untuk pembuatan larutan fisiologi

dengan aquades 100 ml.

TSA (Trypic Soy Agar)

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

241 TBUD TBUD 135 TBUD TBUD

TBUD 216 TBUD 155 251 TBUD

 8

189-4

71-4

1890000 = 1,9 x 10-6

71.0000 = 7,1 x 10-5

1890000 + 710000 = 1300000 = 1,3 x 10-6

2

Keterangan: rata-rata dari pengenceran 104

NA (Nutrient Agar)

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

109 TBUD 189 TBUD 188 TBUD

TBUD TBUD 71 126 27 36

189-4

71-4

1890000 = 1,9 x 10-6

71.0000 = 7,1 x 10-5

13500000 + 15500000 = 14500000 = 1,5 x 107

2

Keterangan: rata-rata dari pengenceran 105