PEMBUATAN MEDIA & STERILISASI ALAT

I. Latar belakang
Dalam melakukan diagnosa mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat
maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan bebas dari
mikroba. Untuk itu dalam mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi dan
pembuatan media. Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan mikroba
dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam mikrobiologi
adalah suatu proses untuk mematikan semua mikroorganisme yang terdapat pada
atau didalam suatu benda. Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan
bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses
sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan
bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan.
Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara
sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium Mikrobiologi ialah
dengan pemanasan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka
disebut sterilisasi panas lembab, bila tanpa kelembaban disebut sterilisasi panas
kering atau sterilisasi kering.
Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme
diatas atau didalamnya. Medium harus mengandung nutrient yang merupakan
substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrient ini
adalah degradasi dari nutrient dengan molekul yang kompleks. Nutrient dalam
medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon,
energi, mineral dan faktor tumbuh.

II. Tujuan

 Untuk dapat mengetahui cara mensterilkan alat-alat

 Untuk dapat mengetahui cara membuat media pertumbuhan mikroorganisme
 Untuk mengetahui jenis medium

III. Alat & Bahan

Adapun alat dan bahan yang dibutuhkan untuk membuat semua media anatar lain :
 Alat
 Labu Erlenmeyer
 Tabung reaksi

1
  Rak tabung
 Cawan petri
 Gelas ukur
 Autoclave
 Air flow (laminar)
 Gelas beaker
 Batang pengaduk
 Hot plate
 Timbangan analitik

 Bahan
 Aquades
 Alcohol 70 %
 NA (Nutrient Agar)
 TSIA (Triplle Sugar Iron Agar)
 PCA (Plate Count Agar)
 MHA (Mueller Hinton Agar)
 LB (Lactosa Broth)
 BGLB (Brilliant Green blue Lactosa Broth)
 Kertas pembungkus
 Aluminium foil
 Kapas
 Plastic wrap
 Tissue
 Kertas label

IV. Prosedur pembuatan media

 Pembuatan media NA (Nutrient Agar)

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk NA sebanyak 12 gr pada neraca analitik menggunakan kertas
perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 600 ml
 Dimasukkan serbuk media secara hati-hati ke dalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan media nya di atas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang bersisa (ditunjukkan warna medianya kuning
jernih) dan saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai
meluap
 Di sterilisasikan media pada Erlenmeyer tersebut yang sudah ditutup dengan
kapas menggunakan autoklaf. Caranya yaitu :
1. Buka tutup autoklaf

2
 2. Masukkan bahan/media ke dalam autoklaf dan susun rapi pada keranjangnya
3. Tutup autoklaf putar/tarik kunci dengan kencang
4. Nyalakan autoklaf dan tunggu hingga suhu mencapai 121°C dan tekanan
sebesar 1 atm (kondisi sterilisasi)
5. Mulai sterilisasi selama 15 menit
6. Setelah selesai matikam autoklaf
7. Tunggu hingga tekanan turun hingga 0 atm (suhu agak dingin)
8. Buka secara perlahan penutup autoklaf
9. Keluarkan media dari dalam autoklaf
 Setelah itu tuangkan media dari Erlenmeyer ke cawan petri sebelum media
menjadi agar
 Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah di cawan petri ke dalam air flow

 Pembuatan media PCA (Plate Count Agar)

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk PCA sebanyak 2,25 gr pada neraca analitik menggunakan
kertas perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 100 ml
 Dimasukkan serbuk media secara hati-hati ke dalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan medianya diatas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang bersisa. Warna medianya kuning
 Disterilisasikan media pada Erlenmeyer tersebut yang sudah ditutup dengan kapas
menggunakan autoklaf. Selama 15 menit pada suhu 121°C
 Setelah itu tuangkan media dari Erlenmeyer ke cawan petri sebelum media
menjadi agar
 Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah di cawan petri ke dalam air flow

 Pembuatan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk TSIA sebanyak 13 gr pada neraca analitik menggunakan kertas
perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 200 ml
 Dimasukkan serbuk media secara hati-hati kedalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan medianya diatas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang bersisa. Warna medianya merah
 Disterilisasikan media pada Erlenmeyer tersebut yang sudah ditutup dengan kapas
menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C
 Setelah itu tuangkan media dari Erlenmeyer ke tabung reaksi dan dimiringkan
sebelum media menjadi agar

3
  Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah ditabung reaksi kedalam air flow

 Pembuatan media MHA (Muelller Hinton Agar)

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk MHA sebanyak 3,8 gr pada neraca analitik menggunakan
kertas perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 100 ml
 Dimasukkan serbuk media secara hati-hati ke dalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan medianya diatas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang tersisa
 Disterilisasikan media pada Erlenmeyer tersebut yang sudah ditutup dengan kapas
menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C
 Setelah itu tuangkan media dari Erlenmeyer ke cawan petri steril sebelum menjadi
agar
 Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah di cawan petri ke dalam air flow

 Pembuatan media LB (Lactosa Broth)

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk LB sebanyak 1,95 gr pada neraca analitik menggunakan kertas
perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 150 ml
 Dimasukkan serbuk media secara hati-hati ke dalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan medianya diatas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang tersisa. Warna dari medianya kuning
 Disterilisasikan media tersebut pada Erlenmeyer yang telah ditutup dengan
aluminium foil menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C
 Kemudian diamkan beberapa menit hingga dingin
 Setelah itu tuangkan larutan LB sebanyak 5 ml dari Erlenmeyer ke tabung reaksi
yang telah berisi tabung durham (posisi terbalik) lalu ditutup masing-masing
tabung menggunakan kapas
 Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah ditabung reaksi ke dalam air flow

 Pembuatan media BGLB (Brilliant Green

 Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
 Ditimbang serbuk BGLB sebanyak 6 gr pada neraca analitikmenggunakan kertas
perkamen dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 150 ml

4
  Dimasukkan serbuk media secara hati-hati kedalam Erlenmeyer
 Ditambahkan aquades dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk
 Dipanaskan medianya diatas hot plate sampai medianya tercampur homogen
sehingga tidak ada kristal yang tersisa. Warna medianya warna hijau tua
 Disterilisasikan media tersebut pada Erlenmeyer yang telah ditutup dengan
aluminium foil menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C
 Kemudian didiamkan beberapa menit hingga dingin
 Setelah itu tuangkan larutan BGLB sebanyak 5 ml dari Erlenmeyer ke tabung
reaksi yang telah berisi tabung durham (posisi terbalik) lalu ditutup kembali
masing-masing tabung menggunakan kapas
 Media yang telah siap dan tidak langsung digunakan sebaiknya dimasukkan
semua media yang sudah ditabung reaksi kedalam air flow

V. Pembahasan
Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba. Selain itu untuk menumbuhkan mikroba, media dapat pula
untuk isolasi, memperbanyak mikroba, pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan
mikroba
Media NA (Nutrient Agar) adalah salah satu media yang umum digunakan untuk
pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif dalam artian
mikroorganisme heterotroph. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari
ekstrak beef, pepton, dan agar. Media PCA (Plate Count Agar) adalah sebuah media
pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk menghitung jumlah
bakteri total (semua jenis bakteri) yang terdapat pada setiap sampel. Media PCA
mengandung nutrisi yang disediakan oleh tryptone, agar, vitamin dari ektrak ragi dan
glukosa yang digunakan sebagai sumber energi bagi mikroorganisme sehingga
mendukung pertumbuhan dari bakteri. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
merupakan media untuk melihat kemampuan suatu mikroorganisme dalam
memfermentasikan gula. Media TSIA memiliki 3 gula dalam kandungannya, yaitu :
glukosa, laktosa dan sukrosa. Media MHA (Mueller Hinton Agar) adalah media
terbaik untuk pemerksaan sensibilitas tes uji zona hambat. Media MHA digunakan
karena memiliki kandungan nutrisi yang baik untuk kultur kebanyakan bakteri. Selain
itu media MHA juga bersifat netral, sehingga tidak menimbulkan pengaruh terhadap
prosedur uji antibakteri. Media LB (Lactosa Broth) adalah media yang digunakan
untuk mendeteksi koliform dalam air. Media LB dibuat dari pepton dan ekstrak beef
yang menyediakan nutrient esensial untuk memetabolisme bakteri dan Laktosa
menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform.
Media BGLB adalah media yang digunakan untuk mendeteksi bakteri koliform.
Media BGLB khususnya digunakan untuk pemeriksaan MPN koliform yaitu
pemeriksaan yang digunakan untuk mengetahui perkiraan jumlah terdekat bakteri coli
dan coloform dan digunakan untuk pada tahap uji penguat(penegasan). Media ini
digunakan dengan maksud untuk media penyubur bagi bakteri coliform sekaligus
sebagai media selektif bagi bakteri selain bakteri coliform. Media BGLB

5
 mengandung laktosa dan garam empedu inilah yang dapat yang mendorong bakteri-
bakteri coliform untuk tumbuh secara optimal.
Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme yang hidup.
Adanya pertumbuhan mikro memyatakan bahwa pertumbuhan bakteri masih
berlangsung dan tak sempurnanya proses sterilisasi. Cara kerja sterilisasi ialah cara
kerja agar terhindar dari kontaminasi,cara steril ini digunakan pada pembuatan media
dan pembuatan preparat. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara :
1. Fisik yang dibagi menjadi beberapa bagian :
a. Dengan oven, bahan dari gelas dibungkus dengan alumunium foil, pada suhu
170-250°C selama 2 jam
b. Panas basah dengan tekanan suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang
digunakan adalah autoklaf
c. Pressure cooker, panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka agar keluar
uap kemudian klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan, bila suhu 121°C
dengan tekanan 1,5 atm, digaja konstan selama 15 menit. Kemudian buka klep
uap hingga tercapai tekanan nol, dan setelah suhu mencapai suhu kamar, alat
dan bahan dikeluarkan.
2. Kimia, dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik.
3. Radiasi, dengan sinar ultra violet, biasanya digunakan pada ruangan dan alat-alat
plastic
4. Filter, dengan membran filter dan vacum pump

Sterilisasi alat
Cara kerja :
 Sterilisasi dengan oven
 Dibungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilkan dengan kertas
pembungkus/aluminium foil
 Buka pintu oven
 Tempatkan alat kedalam oven dengan susunan rapi
 Tutup pintu oven
 Setting suhu oven : 160-180°C selama 1-3 jam
 Mulai sterilisasi
 Setelah seselai matikan oven
 Tunggu beberapa saat sehingga suhu turun
 Keluarkan alat dari oven

Sterilisasi area kerja

Cara kerja :
 Bersihkan meja atau alat dari bahan yang ada diatasnya
 Usap bersih dengan menggunakan tisu
 Semprot merata dengan alcohol 70%
 Ratakan dengan tisu bersih
 Tunggu hingga kering

VI. Kesimpulan

6
Berdasarkan praktikum yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa, sterilisasi
adalah suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama
mikroba. Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi yaitu
masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Media adalah suatu bahan yang
terdiri atas campuran nutrisi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba. Selain
untuk menumbuhkan mikroba, media dapat pula untuk isolasi, memperbanyak
mikroba, pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan mikroba.
Media yang dibuat pada praktikum ini yaitu media NA, media PCA, media TSIA,
media MHA, media LB dan media BGLB