BAB III

METODE KERJA

3.1.Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah bunsen, tabung reaksi dan rak, gelas objek,
inkubator, jarum ose. jar anaerob, inkubator
Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Plate Agar Darah, Thioglycollate Broth
dengan indicator resazurin, Brucella Blood Agar, Kanamycin, Zat warna Gram (Gentian
Violet, Lugol, Alkohol 96%, Safranin)

3.2.Cara Kerja

Inokulasi bakteri pada media pertumbuhan

1) Dilakukan peremajaan bakteri dari media tioglikolat yang sebelumnya menjadi stok
bakteri.
2) Diambil satu ose bakteri dari media tioglikolat yang menjadi stok.
3) Lalu dimasukkan atau di tanam ke dalam media tioglikolat yang baru.
4) Selain itu, ambil kembali masing-masing 1 ose yang kemudia diinokulasi pada media agar
darah, brucella agar, dan brucella kanamisin agar.
5) Masukan semua media tadi ke dalam anaerobik jar.
6) Setelah itu inkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.

Pewarnaan Gram

1) Dibersihkan kaca objek dengan kertas saring dan melewatkannya di api untuk
menghilangkan kotoran dan lemak.
2) Dibuat lingkaran kira-kira berdiameter 2-3 cm di bagian bawah kaca objek menggunakan
pensil penanda dan diberi label.
3) Dibuat sediaan pada kaca objek, yitu suspensi disebarkan d atas kaca objek sehingga
menyerupai lapisan tipis, keringkan, dan di rekatkan dengan melewati api.
4) Dituang crystal violet dan biarkan selama 1 menit.

13
 5) Dicuci dengan air mengalir secara perlahan.
6) Dituang cairan lugol dan diamkan selama 1 menit.
7) Dicuci dengan air secara perlahan lalu mencelupkan ke dalam etil alkohol 95% beberapa
detik sehingga tidak ada lagi zat warna ungu.
8) Dicuci dengan air dan mewarnai dengan safranin selama 45 detik, lalu mencuci dengan air
dan keringkan di udara.
9) Diteteskan satu tetes oil emersi lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x
100.
Identifikasi dengan VITEK

1) Digunakan isolasi bakteri yang ada pada media brucella kanamisin.

2) Disiapkan tabung reaksi yang berisi 3 mL NaCl 0,95%.
3) Diambil koloni bakteri, buat suspensi pada larutan NaCl dan homogenkan.
4) Untuk kekeruhan inokulum dilihat dengan menggunakan alat Densicheck
5) Masukkan tabung ke lubang pengukuran pada Densicheck, putar 360º selama 2 detik.
Angka hasil pengukuran akan muncul dalam satuan McFarland. Bakteri Gram negative dan
positif = 0,5 – 0,63 McFarland. Yeast = 1,8 – 2,2 McFarland.
6) Jika kekeruhan kurang maka tambahkan koloni bakteri/yeast
7) Jika kekeruhan berlebih, maka ambil sejumlah volume inokulum dan diencerkan dengan
menambahkan larutan NaCl
8) Selanjutnya ambil kartu reagen koloritemtri (GN,GP, YST).
9) Letakkan kartu reagen tersebut ke dalam kaset.
10) Pada kaset terdapat lubang untuk menaruh tabung.
11) Tabung yang telah berisi suspensi bakteri diletakkan ke dalam lubang.
12) Dimasukkan selang yang terdapat pada kartu ke dalam tabung yang berisi suspensi bakteri.
13) Selanjutnya kaset dimasukkan ke dalam vitek untuk diproses lebih lanjut sehingga di
dapatkan hasil data identifikasi bakteri.

14