Nama Lengkap : Aderia Nur Hidayah

NIM/Kelompok : M0420001 / 3

Acara 7

PERHITUNGAN JUMLAH MIKROORGANISME

I. Tujuan
Melatih ketrampilan dalam menghitung jumlah mikroorgansime.
II. Dasar Teori
Pengukuran kualitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan
untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Perhitungan
mikroorganisme untuk menghitung jumlah total pertumbuhan
mikroorganisme dilakukan dengan cara pengenceran. Terdapat berbagai
macam cara untuk menghitung mikroorganisme akan tetapi secra
mendasar terdapat dua cara yaitu metode perhitungan secara langsung dan
perhitungan secara tidak langsung. Perhitungan jumlah bakteri secara
langsung digunakan untuk menentukan jumlah bakteri keseluruhan baik
yang mati maupun yang hidup. Sedangkan perhitungan bakteri secara
tidak langsung digunakan untuk menentukan jumlah bakteri yang hidup
saja (viable count) (Rosmania dan Yanti, 2020). Ada beberapa cara
perhitungan secara langsung contohnya dengan membuat preparat dari
suatu bahan (preparat sederhana diwarnai dan tidak diwarnai) dan
mengunakan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan
secara tidak langsung terdapat beberapa cara antara lain metode cawan dan
metode MPN.
Perhitungan total sel dihitung dengan mikroskop fluoresens dengan
metode direct microscopic count (DMC) pada masing-masing preparat
pada setiap perlakuan suhu pengeringan dan hari penyimpanan. Dihitung
juga jumlah sel awal sebelum perlakuan sebagai kontrol. Metode DMC
dilakukan dengan mengamati secara langsung gelas objek yang telah
diinkubasi di bawah mikroskop fluoresens (Nurjanah dkk., 2017). Metode
hitungan mikroskopis langsung dilakukan dengan meletakkan sampel pada
ruang hitung yang disebut hemasitosmeter, kemudian untuk jumlah selnya
 dihitung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan dari metode ini adalah
tidak memerlukan banyak alat dan prosesnya dapat berlangsung cepat.
Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan
sel mati dan sulit menghitung sel berukuran sangat kecil.
Perhitungan bakteri secara Turbidimetri (kekeruhan) dengan
memakai alat spektrofotometer adalah contoh perhitungan jumlah bakteri
secara tidak langsung. Fungsi alat Spektrofotometer adalah melihat tingkat
kekeruhan yang terbaca melalui nilai absorbansi yang dihasilkan
menggunakan dengan panjang gelombang 620 nm (Rosmania dan Yanti,
2020). Keuntungan utama metode turbidimetrik dengan bantuan alat
spektrofotometer adalah memberikan cara sederhana untuk menetapkan
kuantitas zat yang sangat kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh cukup
akurat, dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detector dan
tercetak dalam bentuk angka digital ataupun grafik yang sudah
diregresikan (Seniati dkk., 2019). Pada metode ini mikroba dalam suatu
bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel
bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media,
yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan
menembus medium.
Metode cawan termasuk metode perhitungan bakteri secara tidak
langsung. Prinsip metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang
masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba
karena hanya sel yang masih hidup yang dihitung dan beberapa jenis
mikroba dapat dihitung sekaligus. Metode hitungan cawan memiliki
kelemahan yaitu membutuhkan persiapan dan waktu inkubasi yang cukup
lama untuk menghitung pertumbuhan koloni bakteri pada medium agar
(Rosmania dan Yanti, 2020).
III. Metode
A. Alat
 1. Tabung Reaksi (3 Buah)
2. Cawan Petri (3 Buah)
3. Jarum Ose (1 Buah)
4. Vortex mixer (1 Buah)
5. Inkubator (1 Buah)
6. Pipet Ukur 1 mL (1 Buah)
7. Bunsen Burner (1 Buah)
8. Kapas (Secukupnya)
9. Erlenmeyer (1 Buah)
10. Hemasitometer (1 Buah)
11. Hot Plate (1 Buah)
12. Gelas Ukur 50 mL (1 Buah)
13. Gelas Ukur 10 mL (1 Buah)
14. Neraca Analitik (1 Buah)
15. Spatula (1 Buah)
16. Gelas Beaker 100 mL (1 Buah)
17. Kaca Arloji (1 Buah)
18. Batang pengaduk (1 Buah)
19. L rod (1 Buah)
20. Colony counter (1 Buah)
21. Spidol (1 Buah)
22. Alat tulis (1 Set)
23. Laptop (1 Buah)
B. Bahan
1. NA (Nutrient agar) (Secukupnya)
2. Suspensi Bakteri (Secukupnya)
3. Medium PCA (Plate Count Agar) (2 Gram)
4. Aquades Steril (Secukupnya)
5. Alkohol 70% (Secukupnya)
C. Cara Kerja
1. Metode TPC
a. Pembuatan Media Agar
Alkohol 70% disemprotkan pada meja kerja kemudian di lap lalu seluruh
peralatan ditata

2 gram media PCA ditimbang dengan neraca analitik

50 ml aquades diukur dengan gelas ukur 50 ml

2 gram Media PCA dituang pada tabung erlenmeyer dan dilarutkan

dengan 50 ml aquades

Larutan diaduk untuk menghomogenkan

Erlenmeyer disumbat dengan kapas kemudian dipanaskan diatas hot

plate hingga mendidih

3 buah cawan pertri disiapkan (sudah diberi label blanko pengenceran

10-1, 10-2 dan 10-3)

Mulut cawan metri dipanaskan diatas api bunsen agar steril

Media dituang pada masing masing cawan petri lalu disterilkan

Media dibiarkan memadat

b. Sampeling Air Keran

Ujung keran dipanaskan pada api Bunsen

Air dinyalakan dan dibiarkan mengalir beberapa menit

Botol sampel diambil dan disterilkan diatas api Bunsen

c. Pengenceran Bertingkat
Botol sampel diisi dengan air keran yang mengalir lalu tutup botol
disterilkan dan ditutup kapas
 Tabung reaksi yang sudah diberi label 10-1, 10-2, dan 10-3 disiapkan

Mulut tabung reaksi dipanaskan diatas api bunsen burner

Masing-masing tabung reaksi diisi dengan aquades steril 9 ml

Mulut tabung kembali dipanaskan diatas bunsen burner

1 mL sampel air keran dalam botol diambil dengan pipet dan dituangkan
ke dalam tabung 10-1

Tabung reaksi larutan dihomogenkan divortex mixer

1 mL hasil pengenceran 10-1 diambil dengan pipet lalu dituangkan pada

tabung 10-2 lalu dihomogenkan

1 ml hasil pengenceran 10-2 diambil dengan pipet lalu dituangkan pada

tabung 10-3 lalu dikocok perlahan

d. Inokulasi Sampel Dengan Metode Spread Plate

1mL hasil pengenceran 10-2 diambil dengan pipet tetes lalu ditanamkan
pada media 10-2 secara aseptis

Jarum ose dipanaskan diatas api bunsen hingga berpijar

Sampel disebar dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril

Hasil pengenceran 10-3 dipipet sebanyak 1 mL lalu ditanamkan pada

media 10-3 secara aseptis
 Jarum ose dipanaskan diatas api bunsen hingga berpijar

Sampel disebar secara merata ke seluruh cawan petri dengan jarum ose

Hasil pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1 mL lalu ditanamkan pada

media 10-1 secara aseptis

Jarum ose dipanaskan diatas api bunsen hingga berpijar

Sampel disebar secara merata ke seluruh cawan petri dengan jarum ose

e. Inkubasi dan Perhitungan

Inkubator diatur pada waktu 24 jam dan suhu 30 derajat lalu pintu
inkubator dibuka

3 cawan petri berisi sampel dimasukan dan diletakkan dalam keadaan

terbalik lalu pintu inkubator ditutup

Tunggu hingga 24 jam

Setelah di inkubasi selama 24 jam cawan petri diambil dan dihitung

dengan bantuan alat colony counter

Catat hasil perhitungan

2. Metode Hemasitometer

Alat dan bahan disiapkan

Etanol dioleskan pada support structures lalu dibiarkan hingga menguap

 Kaca tutup Hemasitometer diletakan diatas permukaan hitung
Hemasitometer.

Khamir murni diambil sebanyak 0,1 sampai 0,5 ml dengan pipet

Suspensi dimasukan pada ruang Hemasitometer lalu tutup kaca dilatekan.

Hemasitometer diletakan diatas meja kerja mikroskop dengan hati-hati.

Sampel diamati dengan obyektif berkekuatan rendah dan dihitung
jumlah sel yang terdapat pada 80 buah kotak kecil yang terletak dalam
kotak bagian tengah yang berukuran 1 mm2

IV. Hasil dan Pembahasan

Praktikum acara 7 yaitu “Perhitungan Jumlah Mikroorganisme”
dilakukan dengan tujuan melatih keterampilan dalam menghitung
mikroorganisme. Tujuan tersebut dapat dicapai dengan melakukan
berbagai teknik perhitungan mikroorganisme yang memiliki berbagai
macam cara untuk menghitung mikroorganisme akan tetapi secara
mendasar terdapat dua cara yaitu metode perhitungan secara langsung dan
perhitungan secara tidak langsung. Perhitungan jumlah mikroorganisme
ini dapat dilakukan dengan metode perhitungan mikroskopis langsung
(Direct Microscope Count) dan metode perhitungan cawan (Plate Count
Method).
Metode hitungan mikroskopis langsung sampel akan diletakkan
pada ruang hitung yang disebut hemasitosmeter, kemudian untuk jumlah
selnya dihitung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan dari metode ini
adalah tidak memerlukan banyak alat dan prosesnya dapat berlangsung
cepat. Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat membedakan sel
hidup dan sel mati dan sulit menghitung sel berukuran sangat kecil karena
tidak mungkin memakai lensa obyektif minyak imersi akibat tebalnya
hemasitometer. Hal ini dapat diatasi dengan mewarnai sel sehingga lebih
mudah dilihat. Kesulitan lainnya adalah bila sel menggerombol sehingga
sulit untuk dihitung namun hal tersebut dapat diatasi dengan memisahkan
sel dengan menambah bahan anti gumpal seperti ethylena diamina tetra
asetat dan tween 80 0,1%.
Metode penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara
mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi
yang sangat kecil. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung dapat
menetukan jumlah mikroba secara keseluruhan, baik yang mati maupun
yang hidup. Alat yang digunakan adalah Petroff Hauser Chamber atau
Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat
ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam
satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar
dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak
sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16
kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak
kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang
tersuspensi akan memenuhi volume.
Metode hitungan cawan merupakan cara yang akurat untuk
menentukan jumlah mikroorganisme karena hanya sel yang masih hidup
yang dihitung. Selain itu, beberapa jenis mikrob dapat dihitung sekaligus
dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroorganisme.
Namun metode hitungan cawan memiliki kelemahan yaitu metode ini
membutuhkan waktu minimal 24 jam untuk dapat menentukan kepadatan
bakteri, sehingga metode ini dianggap kurang efektif digunakan untuk
kebutuhan perhitungan dalam waktu yang lebih cepat. Prinsip metode
hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan
pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa
menggunakan mikroskop. Bakteri harus dapat tumbuh dalam medium
padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas (tidak menyebar) dan
memerlukan persiapan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan
koloni dapat dihitung. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua
cara yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan
(surface/spread plate).
 Dalam metode hitungan cawan, sampel yang diperkirakan
mengandung lebih dari 300 sel/ml memerlukan pengenceran sebelum
ditumbuhkan di dalam cawan petri. Pengenceran dilakukan untuk
memperoleh biakan murni baik menggunakan media cair maupun padat.
Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroorganisme sehingga
suatu saat ditemukan satu sel dalam tabung reaksi. Sampel yang telah
diencerkan disebar pada media tertentu. Mikroorganisme yang di tanam
pada media dapat menyebar luas ke seluruh media sehingga perhitungan
jumlah koloni dapat dilakukan dengan mudah. Pengenceran biasanya
dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya, atau
1:100, 1:10000, 1:1000000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk
pengenceran dapat berupa larutan NaCl 0.9% dan bufer fosfat. Jumlah
koloni dalam contoh yang dihitung atau koloni/ml yaitu jumlah koloni per
cawan dikali faktor pengenceran. Setelahnya mikroorganisme yang telah
ditanam ke media PCA tersebut di inkubasi dan akan terbentuk koloni
pada cawan tersebut dalam jumlah yang masih dapat dihitung, dimana
jumlah yang terbaik adalah diantara 30-300 koloni.
Metode TPC merupakan analisis untuk menguji jumlah mikroba
dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan sebar.
Metode ini dilakukan dengan pengenceran bertingkat pada sampel secara
seri, dengan kelipatan 1 : 10 yaitu dengan pengenceran isolat yang telah
diketahui beratnya ke dalam 9 ml larutan aquades steril untuk melarutkan
sekitar 1 ml suspensi ke dalam tabung reaksi tertutup. Dilanjutkan dengan
menuangkan media biakan (nutrient agar) yang merupakan nutrisi untuk
mikroba kedalam cawan petri steil lalu dipadatkan. Kemudian larutan
suspensi bakteri tersebut disebar kedalam cawan petri berisi media biakan
padat dan diratakan dengan jarum ose pada kondisi steril. Setelahnya
dilakukan inkubasi kedalam inkubator dengan suhu 30OC selama 24 jam
dalam keadaan terbalik untuk menghindari kontaminasi akibat
pengembunan. Bakteri tersebut akan bereproduksi pada medium agar dan
membentuk koloni setelah 18-24 jam masa inkubasi. Lalu dilakukan
perhitungan TPC yaitu cara yang paling umum digunakan untuk
menentukan jumlah mikroba yang masih hidup dengan bantuan colony
counter. Rumus yang dipakai untuk menghitung total mikroorganisme
pada metode TPC adalah sebagai berikut (Nurjanah dkk., 2017) :

Jumlah koloni pada cawan

N=
(1 x n1)+(0,1 x n2)+(0.01x n3)

0,1 x n2)+(0.01x n3)xd

dimana, N = total bakteri (CFU/mL); n1 = jumlah koloni pada cawan
pengenceran pertama;(0.01x
n2 = n3)xd
jumlah koloni pada cawan pengenceran kedua;
n3 = jumlah koloni pada cawan pengenceran ketiga; d = pengeceran
pertama yang dihitung.

Perhitungan mikroskop langsung dilakukan dengan bantuan

hemasitometer. Hemasitometer adalah kaca tebal dengan 2 struktur
pendukung ditengahnya. Langkah kerja dalam penghitungan ini dilakukan
dengan mensterilkan bagian struktur pendukung hemasitometer dengan
etanol yang dibiarkan hingga menguap. Setelahnya masukan suspensi
khamir pada bagian struktur pendukung sebanyak 0,1 hingga 0,5 ml
menggunakan pipet hingga ruang hitung terpenuhi oleh susupensi secara
kapiler kemudian letakan kaca penutup. Selanjutnya letakan
hemasitometer di bawah mikroskop diamati dengan obyektif berkekuatan
rendah dan hitung jumlah sel yang terdapat dalam 80 kotak kecil yang
terletak dikotak bagian tengah yang berukura 1 mm2. Cara menghitung
hemasitometer dapat dilakukan dengan pembagian hemasitometer menjadi
9 area yang masing-masing berukuran 1 mm2. Kotak yang ditengah
(kesemua isinya dibatasi dengan garis triple) juga berukuran 1 mm2 dan
dibagi menjadi 25 kotak besar, setiap kotak besar ini dibagi lagi menjadi
16 kotak. Dengan demikian dalam kotak tengah tersebut seluruhnya
terdapat 400 kotak kecil (25 x 16). Misalnya terdapat 500 500 sel khamir
didalam kotak kecil. Maka jumlah sel khamir yang terdapat didalam mili
suspensi asal dapat dihitung dengan cara berikut :
a. 80 kotak kecil mempunyai luas 0,2 mm2. Jadi didalam setiap mili
meter persegi terdapat 500 x 5 atau 2500 sel
 b. Kedalam cairan dibawah Hemasitometer ialah 0,1 mm maka volume
cairan yang tercangkup oleh kotak berukuran 1 mm2 ialah 0,1 mm3.
Artinya terdapat 2500/0,1 mm3 atau 25.000/mm3.
c. 1 ml = 1 cm3 atau 1000 mm3. Maka jumlah sel khamir yang terdapat
didalam suspensi asal ialah 2,5 x 107 sel/mm3

V. Kesimpulan
Perhitungan jumlah sel mikrorganisme dapat dilakukan secara
langsung dan tidak langsung. Metode perhitungan jumlah sel langsung
dapat dilakukan dengan pengamatan langsung dibawah mikroskop dengan
bantuan hemasitometer. Kelebihan dari metode ini adalah tidak
memerlukan banyak alat dan prosesnya dapat berlangsung cepat.
Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan
sel mati dan sulit menghitung sel berukuran sangat kecil. Sedangkan
Metode perhitungan jumlah sel secara tidak langsung dilakukan dengan
metode cawan sebar (TPC) dengan pengamatan dibawah colony counter
pada medium agar yang telah diinkubasi. Kelebihan metode ini adalah
akurat dalam menentukan jumlah mikroorganisme karena hanya sel yang
masih hidup yang dihitung. Selain itu, beberapa jenis mikrob dapat
dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi
mikroorganisme. Namun metode hitungan cawan sebar (TPC) ini memiliki
kelemahan yaitu kurang efektif digunakan untuk kebutuhan perhitungan
dalam waktu yang lebih cepat. Rumus dari perhitungan cawan sebar ini
adalah sebagai berikut :

Jumlah koloni pada cawan

N=
(1 x n1)+(0,1 x n2)+(0.01x n3)

0,1 x n2)+(0.01x n3)xd

(0.01x n3)xd
VI. Daftar Pustaka
Nurjanah S. Sari RN. dan Hariyadi RD. 2017. Ketahanan dan
Kulturabilitas Cronobacter Sakazakii terhadap Stres Kering pada
Simulasi Proses Pengeringan. Jurnal Mutu Pangan. 4(2) : 92-99.
Rosmania dan Yanti F. 2020. Perhitungan jumlah bakteri di Laboratorium
Mikrobiologi menggunakan pengembangan metode
Spektrofotometri. Jurnal Penelitian Sains. 22 (2) : 76-86.
Seniati. Marbiah. dan Irham A. 2019. Pengukuran Kepadatan Bakteri
Vibrio harveyi Secara Cepat Dengan Mengunakan
Spectrofotometer. Agrokompleks. 19(2) : 12-19.
VII. Lampiran
1. Abstrak Jurnal (3 lembar)
2. Highlight Sitasi Jurnal (4 lembar)