PENETAPAN JUMLAH SEL

PENETAPAN JUMLAH SEL DENGAN MENGGUNAKAN RUANG HITUNG (COUNTING CHAMBER) Oleh : Dianty Rosirda Dewi Kurnia, ST

I. PENDAHULUAN a. Latar Belakang Mikroba tersebar secara luas di alam. Dalam kehidupannya mereka tidak membatasi diri tinggal di suatu tempat. Sepanjang tempat tersebut memenuhi persyaratan, maka mikroba tersebut akan hidup. Salah satu metoda yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah sel mikroorganisme adalah dengan menggunakan ruang hitung (counting chamber) yang digunakan dengan bantuan mikroskop. b. Tujuan a. Umum Menentukan konsentrasi sel melalui metode penetapan jumlah sel dengan counting chamber b. Khusus Setelah melaksanakan praktikum mahasiswa dapat : 1. Menentukan letak ruang hitung pada kaca objek yang diamati 2. Menentukan jumlah sel pada objek yang diamati dengan tepat 3. Menentukan konsentrasi sel dari cuplikan (suspensi) yang ditentukan

II. TINJAUAN PUSTAKA Counting chamber merupakan suatu kaca obyek tebal, diatasnya diasahkan suatu dataran yang dalamnya 0,1 mm. Pada dataran ini di buat garis-garis berbentuk 16 persegi besar, pada setiap persegi besar di bagi lagi menjadi 16 persegi kecil. Panjang sisi persegi kecil 0,05 mm. Jika di atas bagian yang diasah ini di letakan sebuah kaca tutup, maka terbentuk suatu ruang yang tingginya adalah 0,1 mm. Tiap-tiap persegi kecil dibawah kaca tutup tersebut merupakan suatu ruang dengan isi 0,05 x 0,05 x 0,1 mm3 = 25. 10 -5 mm3. Jika di bawah kaca tutup tersebut dimasukan setetes suspensi, maka dengan mikroskop dapat di hitung jumlah sel dalam tiap-tiap persegi tersebut, sehingga dapat di hitung pula jumlah sel per ml dari suspensi tersebut. Untuk menghitung konsentrasi sel dilakukan pengamatan terhadap 5 (lima) persegi besar atau 80 (delapan puluh) persegi kecil. Jumlah sel dalam setiap persegi kecil dihitung kemudian jumlahkan seluruh hasil perhitungan untuk ke-80 persegi kecil. Karena letak mikroorganisme hidup tidak teratur, maka dalam menghitung dibuat kesepakatan agar sel yang terletak pada garis tidak dihitung dua kali, yaitu :

Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kanan dan bawah tidak termasuk dalam persegi kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 1 jumlah selnya adalah 6. Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kiri dan atas termasuk dalam persegi kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 2 jumlah selnya adalah 3, pada persegi nomor 6 jumlah selnya 5.

Dari hasil penentuan tersebut dapat ditentukan konsentrasi sel dengan rumus :

Jumlah sel dalam setiap persegi kecil harus berisi sekitar 10 sel. Bila pada saat pengamatan diperoleh jumlah sel lebih besar dari 10 (sepuluh) sel dalam setiap persegi kecil, maka perlu dilakukan pengenceran. Pengenceran harus dilakukan dengan sangat teliti. Konsentrasi sel sesungguhnya bila dilakukan pengenceran adalah : Counting chamber memiliki dua saluran yang dalam pada kedua sisi ruang hitungnya yang berfungsi untuk menampung kelebihan cairan. Kaca tutup yang diletakkan di atas ruang hitung harus kering agar ketinggian dari ruang hitung tetap terjaga. Pada counting chamber model baru, diatas satu kaca objek dibuat 2 ruang hitung yang satu sama lain dipisahkan dengan saluran. III. PERCOBAAN a. Susunan Alat dan Bahan yang Digunakan Alat : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Counting chamber Counter Tabung Reaksi Pipet tetes Pipet ukur Mikroskop Kaca preparat dan tutupnya

Bahan : 1. Suspensi mikroorganisme (ragi, jamur, bakteri). 2. Air steril Deskripsi Alat :

Mikroskop dan Counting chamber b. Prosedur Kerja 1. Kocok suspensi baik-baik agar sel dapat tersebar sama rata dalam cairan 2. Tutup ruang hitung dengan kaca tutup dan teteskan dengan pipet kecil setetes suspensi pada pinggir kaca tutup. Tetesan akan mengalir ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung. 3. Pasang counting chamber pada mikroskop, amati jumlah sel pada setiap persegi kecil. Jika jumlah sel lebih dari 10 sel, lakukan pengenceran. 4. Hitung jumlah sel dalam lima persegi besar (80 persegi kecil) dengan menghitung sel-sel yang berada dalam persegi kecil. 5. Tentukan konsentrasi sel dalam setiap ml-nya 6. Pekerjaan tersebut (mengisi ruang hitung dan menghitung jumlah sel) dilakukan tiga kali. 7. Hitung jumlah rata-rata dari tiga penetapan yang dilakukan.

Prosedur pengenceran :

c. Data yang Diambil Jumlah sel dalam setiap persegi adalah :

IV. KESELAMATAN KERJA

Mikroskop dan counting chamber adalah alat yang mudah rusak/pecah bila tidak digunakan dengan hati-hati. Wajib mengenakan lab-jas. Jangan sampai suspensi mikroorganisme tumpah. Bila tumpah segera bersihkan. Cuci tangan dan semua yang kontak dengan mikroorganisme tersebut. Disarankan untuk sarapan dan minum susu sebelum melaksanakan praktikum

V. PENGOLAHAN DATA konsentrasi sel = .. / ml Rata-rata konsentrasi sel : (konsentrasi sel 1 + konsentrasi sel 2 + konsentrasi sel 3) / 3 Buat pembahasan, kesimpulan dan saran dari percobaan yang dilakukan.

BAB 6 MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA

Kompetensi : - Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme - Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count, MPN dan dengan haemocytometer Menentukan jumlah dan ukuran mikroba a. Menentukan ukuran mikroba Menggunakan mikrometer b. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi) b.1 penghitungan jumlah bakteri hidup (penghitungan tidak langsung) b.1.1 Plate count (hitungan cawan) b.1.1.1 SPC b.1.1.2 TPC b.1.1.3 cara kerja SPC dan TPC b.1.2 MPN b.2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung dengan haemocytometer Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif = 0,01 mm / 10 m. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut

bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi.

Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.

Cara Kerja : Kalibrasi : Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler. Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler. Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi. Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.

cara kalibrasi cara mengukur mikroba

Penentuan ukuran mikroba -Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda. -Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan

-Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama. -Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler. -Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas. -Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :

Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1,54 = 7,7 m 2 X 1,54 = 3,08 m Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a.1. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFUs) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut - Satu koloni dihitung 1 koloni. - Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. - Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. - Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. - Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. - Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.

Cara menghitung sel relatif / CFUs per ml CFUs / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan metode Spread Plate dan Pour Plate. Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFUs / 0,1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFUs / 0,1 ml SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFUs / ml = 5x108 CFUs / ml Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFUs / 1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFUs / 0,1 ml SP = 1 ml = 5x107 CFUs / ml Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistik untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan. Syarat-syaratnya sebagai berikut : Untuk syarat perhitungan SPC dan semua yang berhubungan, dapat dibaca (di sini)

Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Colony Counter. a.1.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count. -Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan rinse) (jika perlu). -Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu. -Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan batang L atau glass beads. -Inkubasi pada suhu 30 C selama 1-2 x 24 jam. -Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan. a.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37 C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut

seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.

Cara kerja : 1. Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). 2. Kocok botol yang berisi air sampel. 3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis. 4. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis. 5. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis. 6. Inkubasi semua tabung pada suhu 37 C selama 48 jam. 7. Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.

Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.

pembahasan lebih lengkap mengenai MPN ada di SINI

A. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Luas kotak sedang : =pxl = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh: Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang = 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan : = 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106 Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml Maka : = 0,004 mm3 = 0,000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106

= jumlah sel x () x 106 = jumlah sel x 2,5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105 Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 1. Cara kerja (digunakan kotak sedang) : 2. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu 3. keringkan dengan tissue. 4. Letakkan cover glass di atas alat hitung. 5. Tambahkan 50 l suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas. 6. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas). 7. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10. 8. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10. 9. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.

Tes Jurnal Praktikum Mikrobiolgi Jilid VI (Penghitungan Jumlah Mikroba Dengan Ruang Hitung)

TES JURNAL 6 PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN RUANG HITUNG

(Sumber :http://www.samyakinternational.com)

1. -

Apakah tujuan percobaan kali ini ? Mahasiswa mampu melakukan pengamatan mikroba pada alat hemasitometer dengan bantuan mikroskop.

- Mahasiswa mampu melakukan perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan ruang hitung. 2. Apa yang Anda ketahui mengenai perhitungan jumlah bakteri ? Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung) Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan mikroba secara langsung antara lain: 1. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. 2. Turbidimetri Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer). 3. Hemasitometer Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

3.

Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ? Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles Malassez. Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegipersegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3. Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org) Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-Improved.

4.

Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri secara langsung ? Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:

Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.

Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel. Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.

5. 6.

Bagaiman cara menghitung sel mikroorganisme dengan ruang hitung ? Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu : Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung. Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung. Bagaiman metode perhitungan untuk percobaan kali ini ? Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan kotakkotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut: Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar (1/0,02) Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel 103 = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak (1/0.02)x 10^3 Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar 25 kotak 50 103 Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel per ml sampel adalah: 12 1,25 106 = 1,5 107.

7.

Apa tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan penggunaan air steril ? Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan tersuspensi dalam air steril.

 Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar tidak terdapat mikrooba lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora dalam air steril ditandai dengan berubahnya warna air steril dari jernih menjadi keruh. 8. Apa tujuan dilakukannya pembersihan hemasitometer menggunakan alkohol Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer dan cover glass dengan menggunakan alkohol. Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan. Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan menggunakan tisu biasa ? Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa. Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan hemasitometer. Hal ini bertujuan agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.

9.

10. Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum pengamatan ? Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba. 11. Berpakah besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada hemasitometer ? 400 kali 12. Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ? Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat diminimalkan. 13. Langkah Kerja ! a. Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah ditumbuhi koloni Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang ditumbuhi koloni terbasahi. b. Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang telah terbasahi dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung terlihat keruh. c. Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas lensa yang telah dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup ruang hitung sampai tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya. d. Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet tetes dan diletakkan pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung.

e. Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas mikroskop dengan hatihati f. Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali. g. Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi kecil) sebanyak dua kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah hemasitometer. Jika jumlah sel kapang dalam 1 persegi kecil > 10 sel dan dalam 1 persegi besar > 100 sel, maka suspensi kapang perlu diencerkan. h. Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger diambil dengan menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10 mL. Kemudian, ditambahkan air steril hingga batas labu takar dan digoyang hingga suspensi kapang homogen. i. Langkah 4 sampai 7 diulangi. j. Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.