ACARA V

PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA (ENUMERASI)

A. LATAR BELAKANG
Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam
suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang
bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakte ri secara
kuantitatif (Jutono, 2008). Menetapan jumlah bakteri dilakukan dengan
menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media
biakan atau membentuk suspense dalam larutan biak (Dwidjosoeputro,2000).
Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini penting dilakukan untuk
mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan
diterapkan pada bahan pangan tersebut (Fardiaz, 2003).
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan
langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat
mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat
tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah
organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus
memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan
secara langsung dapat dilakukan dengan cara antara lain yaitu dengan membuat
preparat dari suatu bahan (preparat sederhana yang diwarnai ataupun tidak
diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan
perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam
pelaksanaanya terdapat beberapa cara yaitu perhitungan pada cawan petri (total
plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah
terkecil atau terdekat (MPN methode) dan calorimeter (cara kekeruhan atau
turbidimeter) (Carrol, 2004).
Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskop yaitu dengan
menghitung sel dibawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi contoh dengan
volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur dengan
menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting chamber). Volume
cairan yang terdapat dalam tiap kotak kecil pada kotak hitung yang dapat
diketahui secara pasti sehingga jumlah sel dapat diketahui (Buckle,2007).
Menurut Juntono (2008) perhitungan mikroba secara langsung dilakukan
dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan yang mati. Terdapat
beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu
1. Counting Chamber
Pada perhitungan ini menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes
suspensi biakan mikroba pada alat ini ditutupi dengan gelas penutup dan
diamati dibawah mikroskop. Jumlah sel mikrobia tiap cc dapat ditentukan
dengan cara menentukan jumlah dari sel rata – rata pada tiap petak yang
volumenya telah diketahui.
2. Pengenceran dan pengamatan mikroskopik
Pada cara ini, preparat mikroskopik dibuat pada gelas benda kemudian
suspensi bahan atau biakan mikrobia yang volumenya telah diketahui
diratakan diatas gelas benda pada luas tertentu. Preparat di cat dan
dihitung dengan cara mengukur garis tengahnya sehingga jumlah
mikrobia yang terdapat pada gelas benda dapat dihitung seluruhnya.
3. Filter membran
Pada cara ini, suspensi bahan atau biakeskan mikrobia disaring, lalu
disaring lagi dengan menggunakan filter membran yang telah disterilkan.
Jumlah sel dari volume yang disaring dapat dihitung dari jumlah sel rata –
rata tiap kesatuan luas pada filter membran.
Sedangkan metode yang digunakan dalam perhitungan secara tidak
langsung yaitu metode perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini
adalah jika mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka
sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitung
cawan merupakan cara yang paling sensitive untuk menghitung jumlah
mikroba karena adanya alasan yaitu hanya sel yang hidup dihitung, beberapa
jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi atau
identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk berasal dari satu sel. Metode
hitungan cawan dibagi menjadi dua yaitu metode tuang (pour plate) dan
metode permukaan (spread plate) (Fardiaz, 2003).
 Pada perhitungan dengan teknik ini harus dipenuhi beberapa syarat yaitu:
 Jumlah koloni tiap cawan petri antara 30-300 koloni atau mendekati 300.
 Tidak terdapat spreader
 Jika N2 ≤ 2 maka hasilnya dirata – rata. N1 adalah pengenceran lebih
N1
Kecil, N2 pengencaran lebih besar.
 Jika N2 ≥ 2 dipakai jumlah pengenceran sebelumnya.
N1
 Jika ada ulangan setelah memenuhi syarat maka hasilnya dirata – rata
 Untuk fungi maka berlaku aturan berikut : jumlah koloni tiap cawan petri
antara 15-150 koloni atau mendekati 150.
 Jika dominasi jamur gunakan jumlah yang rendah. Jika dominasi khamir
gunakan jumlah tinggi.
 Jika ada ulangan maka hasulnya dirata – rata (Gobel, 2008).

B. TUJUAN PRAKTIKUM
Menghitung jumlah mikroba aerob yang terdapat dalam sampel.

C. METODE
1. Alat
 Cawan petri
 Pipet volume
 Colony Counter
 Tabung reaksi
 Jarum batang bengkok
 Lampu spritus
 Rak tabung reaksi

2. Bahan
 Media plate count agar (PCA)
 Aquades
 Air keran
  Air got
 Air sungai
 Tanah

3. Cara Kerja

Diberi tanda pada masing – masing cawan petri dengan label sesuai
dengan tingkat pengencerannya yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5

Dihaluskan sampel misal tanah, lalu ditimbang 1 gram. Untuk sampel cair
diambil 1 ml.

Dimasukan sampel tersebut secara aseptis ke dalam 9 ml aquades steril

(pengenceran 10-1) selanjutnya gojak baik – baik suspense hingga
homogen.

Diambil secara aspetis 1 ml suspens dari pengenceran 10-1 tadi

kepengenceran 10-2 kemudian diambil 1 ml dari pengenceran 10-2
ketabung berisi aquades 10 ml diseri 10-3. Dan seterusnya hingga
pengenceran 10-5.

Diinokulasi secara aseptis pengenceran 10-4 dan 10-5 ke cawan petri steril
sebanyak 1 ml.

Dituangkan media PCA leleh ke dalam cawan petri dan homogenkan,

apabila media telah memadat, dibungkus dan diinkubasi dalam inkubator
dengan suhu 300C selama 24 jam.
 Dihitung koloni yang tumbuh di tiap cawan petri.

D. HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hasil pengamatan tiap pengenceran koloni

No Sampel Metode Pengencera Pengenceran Keterangan

n 10-4 10-5
1. Tanah  Spread Spreader 17 koloni 20 jam
plate
 Pour 34 koloni 40 koloni 20 jam
plate
2. Air sungai  Spread 8 koloni 5 koloni 20 jam
plate
 Pour 29 koloni 5 koloni 20 jam
plate
3. Air keran  Spread 6 koloni - 20 jam
plate
 Pour 9 koloni - 20 jam
plate
4. Air got  Spread Spreader 30 koloni 20 jam
plate
 Pour 11 koloni Spreader 20 jam
plate

E. PEMBAHASAN
Pada praktikum ini menggunakan sampel mikroba berasal dari tanah, air
sungai, air keran, dan air got. Kultur bakteri pada sampel tersebut diencerkan
dimana 1ml bakteri pada sampel cair sedangkan sampel padat diambil 1 gram
lalu di pindahkan ke  pengenceran  dan difortex tujuan pemfortexan ini agar
larutan homogen ,lalu 1ml dari pengenceran  di pindahkan ke pengenceran
selanjutnya lalu difortex kembali, pemindahan itu dilakukan hingga pada
pengenceran 10-5  . Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang
terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung dan Adanya
pengenceran adalah sebagai pemecah koloni bakteri sehingga bakteri
terencerkan dan kemudian diambil untuk tanam pada media, pada kali ini ada 5
pengenceran sehingga jumlah pertumbuhan pada tiap pengenceran berbeda-
beda dan ini juga dipengaruhi oleh media dan kontaminasi.
Setelah diencerkan bakteri  ditumbuhkan  pada media di permukaan agar
dengan cara  1ml pengenceran  di pindahkan ke tabung reaksi 1 dan lalu 1ml lagi
dipindahkan ke tabung raksi 2, setelah itu 1ml pengenceran  di pindahkan ke
tabung reaksi 3 dan 1ml lagi dipindahkan ke tabung reaksi 4 dan yang terakhir 1
ml dipindahkan ke tabung reaksi 5. Perlunya hati-hati agar mikropipet dan
media tetap berada di dekat Bunsen serta penggantian tips pada setiap
pengenceran. Setelah itu di inkubasi selama 24 jam dan telah di dapat hasil
sebagaimana yang ada pada tabel, Penghitungan bakteri dilakukan dengan
menggunakan colony counter.
Berdasarkan tabel pengamatan dapat diketahui pada sampel tanah
dengan pengenceran 10-4 didapatkan spreader dan pengenceran 10-5 didapatkan
17 koloni dengan menggunakan metode spread plate. Sedangkan pada sampel
tanah dengan menggunakan metode pour plate didapatkan 34 koloni pada
pengenceran 10-4 dan didapatkan 40 koloni dengan pengenceran 10 -5. Kemudian
pada sampel air sungai dihasilkan 8 koloni dengan pengenceran 10 -4 dan 5 koloni
pada pengenceran 10-5, pengamatan ini menggunakan metode spread plate.
Sedangkan pada pengamatan sampel air sungai dengan menggunakan metode
pour plat didapatkan 29 koloni dengan pengenceran 10 -4 dan terdapat 5 koloni
pada pengenceran 10-5. Selanjutnya pada sampel air keran didapatkan 6 koloni
dengan pengenceran 10-4 dan pada pengenceran 10-5 tidak didapatkan koloni
bakteri, pengamatan ini dilakukan dengan metode spread plate. Sedangkan pada
pengamatan dengan menggunakan metode pour plate dihasilkan 9 koloni
dengan pengenceran 10-4 dan tidak ditemukan koloni pada pengenceran 10 -5.
Dan yang terakhir yaitu pada sampel air got dihasilkan spreader dengan
pengenceran 10-4 dan dihasilkan 30 koloni dengan pengenceran 10 -5,
pengamatan ini dilakukan dengan metode spread plate. Sedangkan pada
pengamatan menggunakan metode pour plate dihasilkan 11 koloni dengan
pengenceran 10-4 dan spreader dengan pengenceran 10-5.
Berdasarkan hasil pengamatan dapat diketahui bahwa jumlah koloni
mikroba terbanyak yaitu pada sampel tanah, karena pada sampel tanah memiliki
jumlah koloni sebanyak 40 koloni dengan pengenceran 10-4 . Sedangkan sampel
yang terendah mikrobanya adalah pada sampel air keran yaitu tidak ditemukan
sama sekali pada pengenceran 10-5. perhitungan ini sudah akurat karena
menggunakan teknik perhitungan secara tidak langsung sehingga jumlah koloni
dapat dihitung baik bakteri yang hidup maupun bakteri yang mati. Perhitungan
secara tidak langsung ini juga dapat digunakan untuk isolasi mikrobia.
Adapun beberapa faktor yang mempengaruhi perhitungan bakteri dengan
teknik secara tidak langsung yaitu diantaranya adalah
1. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka
jumlah bakteri yang dikandungnya akan semakin sedikit
2. Temperatur dan pH, berkaitan dengan temperatur dan pH optimum dari
suatu jenis bakteri
3. Komposisi medium yang digunakan untuk inokulasi harus sesuai dengan
bakteri yang akan dihitung
4. Ketrampilan dan ketelitian dalam pengunaan alat.

Pada praktikum ini menggunakan Uji Aerobic Plate Count (APC)

merupakan uji mikrobiologi untuk mengetahui total jumlah sel hidup atau coloni
forming unit (CFU) yang ada pada mikrobia mesofilik aerob. Prinsip kerja dari uji
ini adalah sampel yang telah dihomogenkan (divortex) diencerkan dengan
larutan pengencer sampai faktor pengenceran tertentu (10 -1 sampai 10-5). Setiap
pengenceran diambil 0,1 ml dan dilakukan plating ke medium PCA (Plate Count
Agar) dengan metode spread plate dan pour plate , kemudian diinkubasi selama
24 jam pada suhu 370C dan selanjutnya dilakukan penghitungan koloni yang
tumbuh dengan rumus. Medium PCA (Plate Count Agar) ini merupakan medium
yang berfungsi untuk menumbuhkan seluruh mikrobia yang hidup pada sampel.
Keuntungan menggunakan media PCA ini yaitu Nutrisi pada medium cukup
lengkap sehingga dapat menumbuhkan banyak jenis mikrobia.
 Kelebihan menggunakan perhitungan mikroba dengan metode hitungan
cawan (enumerasi tidak langsung) dibandingkan enumerasi langsung yaitu :

1. Dapat menghitung sel atau koloni yang masih hidup yang dihitung

2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus

3. Tidak perlu bantuan mikroskop untuk menghitung mikroba

4. Ketelitian tinggi apabila dilakukan dengan benar

5. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba

Kelebihan perhitungan tidak langsung yaitu sel mikrobia yang dapat

dihitung hanyalah sel mikrobia hidup, beberapa mikrobia atau jasad renik dapat
dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia
sedangkan kekurangan metode perhitungan tidak langsung yaitu hasil
perhitungan dengan menggunakan metode ini tidak menunjukkan jumlah sel
yang sebenarnya, bila medium dan kondisi inkubasi berbeda, maka akan
menghasilkan jumlah perhitungan yang berbeda pula, mikrobia yang akan
dihitung jumlahnya harus dapat hidup pada medium padat dan dapat
membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar,
memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga koloni dapat
dihitung (Hansen,2000).

F. Kesimpulan

Pada praktikum ini dapat disimpulkan bahwa enumerasi jumlah koloni

mikroba terbanyak yaitu pada sampel tanah dengan jumlah 40 koloni pada
pengenceran 10-5, sedangkan sampel yang terendah mikrobanya adalah pada
sampel air keran yaitu tidak ditemukan sama sekali pada pengenceran 10-5.
Adapun perbedaan jumlah koloni ini disebabkan oleh beberapa faktor yaitu
diantaranya adalah faktor pengenceran, faktor temperatur dan pH, faktor
komposisi medium, dan faktor Ketrampilan dan ketelitian dalam pengunaan alat.
Dan adapun keuntungan penggunaan media PCA pada praktikum ini yaitu
Nutrisi pada medium cukup lengkap sehingga dapat menumbuhkan banyak jenis
mikrobia.

DAFTAR PUSTAKA
 Buckle.2007. Ilmu Pangan. Jakarta : UI Press

Carrol, B. & M. Freund. 2004. Factor Affecting Haemocytometer Counts of

Sperm Concentration in Human Semen. The Journal of the Society. Vol. 2.

Dwidjosaputro.2000. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fardiaz, S. 2003. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia

Pustaka Utama.

Hadioetomo, R.S. 2009. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta :

Gramedia Utama.

Hansen, P. J. 2000. Counting of Bacterial Colony Forming Units for Direct

Enumeration of Viable and Total Bacteria in Drinking Water. Departement of Civil
Engineering Journal of Microbiological Methods Canada. Vol. 37. Hal. 77-79.

Jutono, dkk. 2008. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : UGM

Waluyo, L. 2007. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang :

UMM Press.