TAHAPAN KULTUR JARINGAN

STERILISASI
1. Sterilisasi Ruangan
Ruangan laboratorium disterilisasi dengan menyapu dan mengepel ruangan serta meja kerja
secara keseluruhan menggunakan desinfektan. Kegiatan tersebut diulangi setiap hari sebelum
dan sesudah proses kultur jaringan dilaksanakan. Ruangan Laboratorium juga disterilisasi
menggunakan sinar ultraviolet (UV) yang terdapat pada LAFC selama dua jam setiap hari
sebelum digunakan. Rak kultur disemprotkan dengan alkohol 70% setiap hari untuk
menghindari sumber kontaminan.
2. Sterilisasi Alat
a. Sterilisasi Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Sterilisasi LAFC dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 70 % lalu di lap dengan
tisu. blower dinyalakan untuk mengalirkan udara agar ruang LAFC terbebas dari sumber
kontaminan. Sinar Ultraviolet (UV) yang terdapat pada LAFC dinyalakan selama 1-2 jam
sebelum digunakan.
b. Sterilisasi Peralatan Kerja
Sterilisasi peralatan kerja seperti botol kultur, gelas kimia, cawan petri, gelas ukur,
Erlenmayer, alat-alat diseksi (scalpel, pinset, gunting) direndam selama 2 – 3 jam dengan
larutan Bayclin. Peralatan kerja selanjutnya dicuci bersih menggunakan deterjen dan
dikeringkan. Peralatan kerja seperti cawan petri dan alat- alat diseksi (scalpel, pinset,
gunting) dibungkus dengan menggunakan kertas, kemudian semua peralatan kerja tersebut
disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC selama 20 – 25 menit.
3. Sterilisasi Bahan
a. Sterilisasi air mineral
Sterilisasi air mineral dilakukan dengan memasukkan air kemasan isi ulang ke dalam
botol kaca sebanyak 2/3 dari total daya tampung botol kaca. Lalu disterilkan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC pada tekanan 15 Psi selama 25 – 30 menit.
b. Sterilisasi media
Sterilisasi media dilakukan pada media yang telah dimasak dan dimasukkan ke dalam
botol kultur sebanyak lebih kurang 25 mL dan ditutup rapat menggunakan aluminium
 foil. Media disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC pada tekanan 15 Psi
selama 25 – 30 menit.

PEMBUATAN MEDIA
Media inisiasi yang digunakan adalah Murashige & Skoog Instan (MS). Pembuatan media
dalam 1 Liter dilakukan dengan mencampurkan 500 mL air terlebih dahulu, kemudian
ditambahkan 4,43 g/L media MS dan 7 gram agar-agar ke dalam Beaker glass. Selanjutnya,
ditambahkan 30 g/L gula dan air sampai volume akhir 1000 mL. Larutan diaduk hingga larut lalu
dimasukkan ke dalam panci stainless steel dan dipanaskan menggunakan kompor hingga
mendidih. Larutan diukur derajat keasamannya (pH) menggunakan kertas lakmus/pH meter
hingga mencapai pH 5,8. Apabila pH terlalu asam maka ditambahkan NaOH, namun apabila pH
terlalu basa ditambahkan HCl. Larutan dimasukkan ke dalam botol kultur steril dengan volume
25 mL dan ditutup rapat. Selanjutnya disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC dengan
tekanan 15 Psi selama 25-30 menit. Setelah disterilisasi, botol kultur yang berisi media disimpan
di tempat steril, dan diamati selama 3 hari untuk melihat apakah media terkontaminasi atau tidak.

ALUR KERJA INISIASI

1. Sterilisasi Eksplan
Eksplan dipilih yang unggul dan bebas penyakit. Eksplan yang akan ditanam dicuci bersih
menggunakan air mengalir. Eskplan direndam dalam larutan deterjen (1 g/L) selama 10 menit,
lalu dibilas menggunakan air steril sebanyak tiga kali. Eksplan selanjutnya dimasukkan ke
dalam larutan fungisida (2 g/L) selama 20 menit sambil dikocok sesekali, lalu dibilas
menggunakan air steril sebanyak tiga kali, setelah itu dilanjutkan perendaman eksplan pada
larutan bakterisida (2 g/L) selama 20 menit, lalu dibilas menggunakan air steril sebanyak tiga
kali.
Sterilisasi selanjutnya dilakukan di dalam LAFC. Eksplan disterilisasi lagi dengan
merendam bakal eksplan secara berturut-turut dalam larutan larutan NaOCl (Natrium
Hipoklorit) 15% selama 5 menit dan dilanjutkan dengan perendaman larutan NaOCl (Natrium
Hipoklorit) 5% selama 5 menit, kemudian eksplan dibilas menggunakan air steril sebanyak tiga
kali. Selanjutnya bakal eksplan yang telah bersih dan steril dimasukkan ke dalam botol yang
berisi air steril sebelum ditanam agar eksplan tidak kering.
 1. Inisiasi
Proses penanaman dilakukan dengan mengambil bakal eksplan lalu diletakkan diatas
cawan petri. Kemudian dibedah menggunakan alat diseksi yaitu pinset dan scalpel untuk
membuang bagian yang tidak dibutuhkan seperti tulang daun bagian tengah. Potong bagian
eksplan daun atau pucuk menggunakan gunting steril dengan ukuran disesuaikan, semua
bagian eksplan harus terpotong untuk memaksimalkan pertumbuhan kalus. Rendam eksplan
dalam larutan vitamin C (2 g/L) dan larutan amoxillin (2 g/L) selama 3 menit. Selanjutnya
diletakkan pada cawan petri lainnya yang kering dan bersih. Kemudian eksplan siap di inisiasi
sesuai perlakuan.
Eksplan selanjutnya ditanam pada media inisiasi dengan menggunakan pinset dan ditekan
perlahan, bibir botol disterilkan lagi menggunakan lampu Bunsen, kemudian ditutup
menggunakan alumunium foil dan plastic wrap. Setelah proses penanaman eksplan selesai,
botol-botol tersebut diletakkan di rak kultur dan di semprot menggunakan alkohol 70%.
Lampu rak dinyalakan dengan pencahayaan sepanjang waktu.
2. Pemeliharaan
Botol kultur yang telah ditanami eksplan diletakkan di atas rak kultur. Ruangan kultur
harus selalu dibersihkan agar terhindar dari kontaminasi. Botol yang berada pada rak kultur
disemprotkan alkohol 70% setiap harinya. Apabila objek penelitian mengalami kontaminasi,
maka botol kultur yang terkontaminasi langsung dipisahkan dan dibawa keluar agar terhindar
dari terjadinya kontaminasi pada objek penelitian yang lain.

MULTIPLIKASI
Proses kerja subkultur atau multiplikasi yaitu semua alat dan bahan yang akan digunakan
dalam proses multiplikasi disiapkan terlebih dahulu. Lampu dan blower pada LAFC
dinyalakan, kemudian LAFC disemprot dengan alkohol 70% dan diseka menggunakan tisu.
Dinyalakan api Bunsen. Lalu scalpel, blade, serta pinset direndam ke dalam alkohol 96% dan
dibakar di atas api Bunsen ketika hendak digunakan. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan
jamur atau bakteri yang menempel. Lalu diambil planlet tanaman pada botol kultur yang akan
dimultiplikasi.
1. Subkultur 1
 Eksplan yang steril setelah diinkubasi selama satu bulan setelah tanam inisiasi
dipindahkan atau disubkulturkan dari media inisiasi ke media multipikasi dengan cara
gerombol tunas yang tumbuh pada pangkal potongan ruas dipisahkan menjadi gerombolan
kecil. Planlet diletakkan di atas tisu yang terdapat pada cawan petri, bagian yang tidak bagus
dari planlet dipotong dan dipisahkan menggunakan scalpel. Setelah itu, batang planlet
dipotong menjadi 3-5 bagian. Eksplan yang telah dipotong tersebut ditanam kembali pada
media kultur yang baru dalam posisi tegak (bagian bawah planlet ditancapkan ke media
kultur). 1 botol kultur diisi dengan 3-5 eksplan (dapat disesuaikan). Botol kultur ditutup
kembali menggunakan aluminium foil yang telah dipanaskan di atas Bunsen, dan dililitkan
dengan plastic wrap. Setelah proses penanaman eksplan selesai, botol-botol tersebut
diletakkan di rak kultur dan diinkubasi kembali selama 1 bulan dan di semprot menggunakan
alkohol 70% setiap harinya. Lampu rak dinyalakan dengan pencahayaan sepanjang waktu.
2. Subkultur 2
Eksplan yang telah berubah menjadi tanaman utuh (planlet) dengan kriteria akarnya
sudah tumbuh, tingginya sekitar 3-5 cm dan jumlah daun sebanyak 3-5 daun, disubkultur atau
dipindahkan kedalam media perakaran dengan cara bagian akar dan daun yang menguning
dihilangkan, dan planlet tersebut dipotong setinggi 3 cm, kemudian planlet atau bahan tanam di
t a n a m kedalam media p e r a k a r a n tersebut. Kegiatan subkultur (pemindahan bahan tanam
ke media baru) dilakukan untuk memperbesar serta penggandaan eksplan menjadi planlet,
sehingga planlet tersebut telah siap untuk diambil bagian tunasnya dan dijadikan sebagai bahan
tanam untuk dipindahkan kedalam media perakaran dan diamati pertumbuhannya.

AKLIMATISASI
Planlet yang akan diaklimatisasi disiapkan dan planlet dikeluarkan dari botol kultur,
kemudian dicuci di bawah air mengalir untuk membuang media agar yang menempel, terutama
pada bagian akarnya. Planlet yang bergerombol dipisahkan dengan menggunakan gunting,
kemudian plantlet direndam dalam larutan fungisida selama 1 menit, kemudian disiapkan bubuk
hormon penumbuh akar dalam wadah dengan menambahkan air secukupnya sehingga terbentuk
larutan hormon penumbuh akar yang encer. Setelah itu, bagian akar planlet dicelupkan pada
larutan hormon yang telah disiapkan, kemudian disiapkan bak aklimatisasi yang sudah berisi
media pasir silika. Media diaduk sambil disemprot dengan air hingga media lembap basah
merata, kemudian planlet ditanam di media aklimatisasi. Bak plastik yang sudah penuh ditanami
planlet disemprot air dan vitamin B-1 hingga menjadi lembap. Setelah itu, bak ditutup dengan
plastik transparan dan diikat dengan karet, kemudian pada bak aklim diberi label jenis tanaman,
tanggal aklimatisasi, dan jumlah plantlet pada bak aklimatisasi tersebut.

PERKIRAAN PEMBUATAN MEDIA

Dalam 1 L media membutuhkan :
Media MS = 4,43 g
Gula = 30 g
Agar = 7 g
Menghasilkan 30 botol media dengan isi per media sebanyak 33 mL (botol kultur besar)

Apabila terdapat 1000 botol, maka membutuhkan media sebanyak ±33 Liter.