KD. 3.

3 Menganalisis Teknik Sterilisasi Ruang, Alat

dan Bahan Kultur Jaringan Tanaman Hortikultura

➢ Pengertian dan tujuan sterilisasi

 Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari
segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi
adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi
sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi eksplan.
Sterilisasi mempunyai peranan penting dalam keberhasilan teknik kultur
jaringan. Guna mencegah terjadinya kontaminasi maka perlu dirancang suatu
laboratorium/ruang kerja kultur jaringan yang khusus, terpisah antara bagian persiapan,
pembuatan media dan ruang penanaman.
Kegiatan mensterilkan alat harus dilakukan dengan benar sehingga hasil yang
diperoleh dapat maksimal. Pengertian dari teknik aseptis yaitu suatu sistem cara bekerja
yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk
mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.Pengenalan
alat-alat laboratorium penting dilakukan untuk keselamatan kerja di laboratorium. Alat-
alat laboratorium dapat rusak atau bahkan berbahaya apabila penggunaannya tidak
sesuai dengan prosedur.

➢ Teknik sterilisasi ruang

Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang
digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak terlalu
besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan
dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang
dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang
ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi
ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta
dimatikan saat masuk dalam ruang ini.

➢ Teknik sterilisasi alat

Alat-alat tanam seperti cawan petri, gagang skalpel, pinset, gunting,
sebelum digunakan harus disterilkan dulu. Demikian juga botol kultur kosong atau botol
berisi akuades, botol berisi kapas atau lipatan kertas tisu kering. Untuk mencuci
botol/alat yang terkontaminasi haruslah dibedakan/dipisah dengan alat untuk mencuci
botol/alat yang tidak terkontaminasi, baik kain pencuci, sikat dan wadahnya. jadi
botol/alat yang berisi tanaman yang terkontaminasi terlebih dahulu di autoklaf sebelum
dicuci secara bersih di westafel.Jika kita tidak memiliki autoklaf dalam jumlah banyak,
kondisi ini dapat diatasi dengan cara memisahkan tempat dan alat pencucian botol/alat
yang terkontaminasi dengan botol/alat yang tidak terkontaminasi. Botol/alat yang
terkontaminasi harus dicuci 2 kali untuk memastikan botol/alat benar-benar bersih
sebelum dilanjutkan dengan mengautoklafnya (mengautoklaf alat yang terkontaminasi
pada autoklaf yang berbeda). Setelah diautoklaf, kemudian direndam satu malam.Alat
yang telah direndam kemudian dicuci dengan air mengalir dan diletakkan di rak peniris
agar alat tersebut kering.
Sterilisasibasah yang dilakukan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dengan
tekanan 1,2atmselama 30 menit. Autoklaf harus mencapai suhu dan tekanan tersebut
sebelum waktu sterilisasi dimulai. Semua alat harus dibungkus dulu dengan alumunium
foil atau dibungkus kertas lalu dimasukkan kedalam plastik, sebelum disterilkan dengan
autoklaf. Botol-botol kosong atau berisi akuades, kapas atau kertas tisu harus ditutup
dengan plastik dan diikat karet, atau ditutup dengan alumunium foil sebelum disterilkan.
Banyaknya air dalam autoklaf dicek terlebih dahulu. Jika air kurang dari batas yang
ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Air yang digunakan air hasil
destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.Autoklaf ditutup dengan
rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir
autoklaf.Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 30 menit pada suhu
121oC. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 30 menit dimulai sejak
tekanan mencapai 1,2 atm.Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan
dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum
pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka
dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.Setelah disterilkan, alat-alat ini dibawa ke
ruangan yang bersih, sampai saat digunakan. Waktu selesai sterilisasi alat hingga alat
digunakan tidak boleh terlalu lama, biasanya hanya 1 atau 2 hari saja.
Sterilisasikeringdilakukanterlebihdahuludenganmembungkusalat-
alatgelasdenganmenggunakankertasataualumunium foil, kemudianaturpengatursuhu
oven menjadi 180°C danalat di sterilkan 2- 3 jam.
Sterilisasipadasaatpenanaman eksplan atau subkultur, nyalakan LAF 30 menit
sebelum digunakan agar HEPA yang terdapat pada LAF mensterilkan udara pada LAF.
Bersihkan tempat kerja dengan Alkohol dengan mengelap ruang dalam LAF.Pasangkan
bunsen ke bahan bakarnya.Nyalakan api bunsen dengan pemantik atau korek api.Alat
yang akan di sterilisasi di flamir di atas bunsen.

➢ Teknik sterilisasi bahan

Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat
berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan,
misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung
pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya,
umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan),
musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi
eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan
eksplannya.
Sterilisasi eksplan dilakukan dengan cara dicuci menggunakan deterjen (2g/L, 10
menit), direndam dalam fungisida kontak (3 g/L, 2 jam), dan bakterisida (3 g/L, 1 jam)
yang dilakukan di luar LAF. Perkejaan berikutnya dilakukan di dalam LAF, eksplan
direndam dalam larutan NaOCl konsentrasi 10% (v/v) dan tween 20 (2 tetes). Lama
perendaman bervariasi bergantung pada perlakuan. Setelah eksplan disterilasi kemudian
ditanam pada media MS.
Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalahcalcium
hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2),alkohol dsb.
Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantungdari jenis eksplan
dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalamrumah kaca relatip lebih
bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan padaumumnya lebih kotor, lebih
terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedursterilisasi harus dibuat lebih keras
dengan meningkatkan konsentrasi bahanpensteril atau dengan memperpanjang waktu
sterilisasi.
Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehinggaperlu
dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yangmenempel
dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril,seringkali ditambahkan 1
atau 2 tetes agensia pembasah (Triton-X , Tween 20atau Tween 80) yang fungsinya
menambah tegangan pada permukaan eksplan.Penggunaan pompa vakum juga dapat
meningkatkan penetrasi bahan pensterilpada permukaan jaringan sehingga dapat
meningkatkan efisiensi sterilisasi.
Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergentdan
dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30menit juga
diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih pekaterhadap bahan pensteril.
Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannyakemudian dibawa kedalam ruang steril
untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuksterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua
atau lebih bahan pensteril,misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite
kemudian dicuci denganair steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan
sublimate danpembilasan dengan air steril.

❖ Sumber
Sugiarto, L. 2018. Pembuatan Media dan Metode Sterilisasi. Universitas
Negeri Yogyakarta. Diakses pada tanggal 11 Januari 2018 di
staffnew.uny.ac.id/upload/132326898/.../pengenalan-lab-kuljar.pdf

Yusnita. 2010. Perbanyakan In Vitro Tanaman Anggrek. Universitas Lampung. Bandar

Lampung.

Ardiansyah, R., Supriyanto, A. S. Wulandari, B. Subandi, dan Y. Fitriani. 2014. Teknik

Sterilisasi Eksplan dan Induksi Tunas dalam Mikropopagasi Tembesu
(Fagraea fragrans Roxb.). Fakultas Kehutanan. IPB. Bogor.