Tugas Kultur Jaringan Kelompok 6

Materi Kultur Jaringan

Sterilisasi
A. Sterilisasi
Kultur jaringan adalah salah satu metode yang digunakan dalam pengembangan
Bioteknologi Tumbuhan. Metode ini merupakan prosedur pemeliharaan dan pertumbuhan
jaringan tanaman (sel, kalus, protoplas) serta organ (batang, akar, embrio) pada kultur aseptis (in
vitro). Metode kultur jaringan diantaranya digunakan untuk perbanyakan tanaman, modifikasi
genotip (plant breeding), produksi metabolit sekunder, pemeliharaan plasma nutfah,
penyelamatan embrio (embryo rescue) (Hartmann dkk., 1997).
Menurut Pierik (1977), ada beberapa kelebihan metode kultur jaringan dibandingkan
metode yang lain yaitu
1. Metode perbanyakan lebih cepat dibandingkan metode yang lain;
2. Metode ini digunakan untuk perbanyakan tanaman yang sulit diperbanyak dengan metode
konvensional;
3. Tanaman hasil kultur jaringan mempunyai jaringan yang lebih kuat dibandingkan metode
yang lain ;
4. Dapat digunakan untuk memperoleh tanaman yang bebas penyakit dan tidak terbatas oleh
musim dalam pelaksanaanya.
Prinsip dasar kultur jaringan adalah teori totipotensi menurut Schwann dan Schleiden
(1838) yang menyatakan bahwa setiap sel mempunyai kemampuan untuk tumbuh menjadi
individu baru jika berada pada lingkungan yang sesuai. Kondisi lingkungan untuk kultur jaringan
harus terkontrol baik dari segi suhu, kelembaban dan cahaya. Selain kondisi lingkungan yang
terkontrol, suplai nutrisi dan penambahan zat pengatur tumbuh juga sangat penting.
Zat pengatur tumbuh sangat penting digunakan untuk mengontrol organogenesis dan
morfogenesis dalam pembentukan dan perkembangan tunas dan akar, serta pembentukan kalus.
Penggunaan ZPT tergantung pada arah pertumbuhan jaringan tanaman yang diinginkan. Jenis
dan konsentrasi ZPT untuk setiap tanaman berbeda tergantung pada genotip dan kondisi
fisiologi jaringan tanaman (Endang G. Lestari, 2011). Metode kultur jaringan merupakan
prosedur laboratorium aseptis yang membutuhkan fasilitas yang unik dan keahlian khusus.
 Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan agar metode kultur jaringan dapat
dilaksanakan,diantaranya adalah
1. Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan
2. Alat dan bahan yang dperlukan dalam metode kultur jaringan tumbuhan
3. Metode Sterilisasi
1. Metode Sterilisasi
Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari segala
kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi adalah tahap kunci
keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi
alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi eksplan.
1.1 Sterilisasi Ruang
Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang digunakan
untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak terlalu besar agar
proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan
menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi dengan
alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang inokulasi akan
digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi ruang, dan biasanya
selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta dimatikan saat masuk
dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).
1.2 Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%.Permukaan laminar
sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol
70%.Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan
selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar.Hal serupa
juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi.Laminar harus tetap
dijaga kebersihannya.
1.3 Sterilisasi Alat dan Media
Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat disterilkan
dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave pada
temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi bahan atau
media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain disterilkan
 dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen. Botol-botol
yang akandisterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau plastik dan diikat
dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30 menit.
1.4 Sterilisasi Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat berupa
organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan, misalnya daun,
batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung pada jenis
tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya, umur
tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan), musim saat
pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya.Pada prinsipnya, sterilisasi eksplan adalah
mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan eksplannya (Edhi
Sandra, 2013).
2. Sterilisasi Secara Mekanik (filtrasi)
Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat
kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut.
Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan
antibiotik.
Jika terdapat beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan
mengalami perubahan atau penguraian, maka sterlisasi yang digunakan adalah dengan cara
mekanik, misalnya dengan saringan. Dalam mikrobiologi, penyaringan secara fisik paling
banyak digunakan adalah dalam penggunaan filter khusus misalntya filter berkefeld, filter
chamberlan, dan filter seitz. Jenis filter yang dipakai tergantung pada tujuan penyaringan dan
benda yang akan disaring. Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan
melalui suatu bahan penyaring yang memilki pori-pori cukup kecil untuk menahan
mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar sedangkan cairan atau gas
yang melaluinya akan steril. Alat saring tertentu juga mempergunakan bahan yang dapat
mengabsorbsi mikroorganisme.Saringan yang umum dipakai tidak dapat menahan virus.Oleh
karena itu, sehabis penyaringan medium masih harus dipanaskan dalam
autoclave.Penyaringan dilakukan untuk mensterilkan substansi yang peka tehadap panas
seperti serum, enzim, toksin kuman, ekstrak sel dan lain-lain.
 2.1 Menyaring cairan
Hal ini dapat dilakukan dengan berbagai filter seperti saringan seitz, yang menggunakan
saringan asbestos sebagai alat penyaringannya; saringan berkefeld yang mempergunakan
filter yang terbuat dari tanah diatom; saringan chamberland yang mempergunakan filter
yang terbuat dari porselen; dan fritted glass filter yang mempergunakan filter yang terbuat
dari serbuk gelas. Saringan asbes lebih mudah dan lebih murah daripada saringan
porselen.Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselen
terlalu mahal bila dibuang, tetapi terlalu sulit untuk dibersihkan.
2.2 Menyaring udara
Untuk menjaga suatu alat yang sudah steril agar tidak tercemar oleh mikroba atau untuk
menjaga agar suatu biakan kuman tidak tercemar oleh kuman yang lain, maka alat-alat
tersebut harus ditutup denagn kapas, karena kapas mudah ditembus udara tetapi dapat
menahan mikroorganisme. Harus dijaga agar kapas tidak menjadi basah, oleh karena
kapas yang basah memungkinkan kuman menembus ke dalam.Untuk mencegah
pencemaran oleh kuman-kuman udara pada waktu menuang pembenihan, dapat
dipergunakan suatu alat yang disebut laminar flow bench dimana udara yang masuk ke
dalamnya disaring terlebih dahulu dengansuatu saringan khusus.Saringan ini ada batas
waktu pemakaiannya dan harus diganti dengan yang baru apabila sudah tidak berfungsi
lagi.
3. Sterilisasi Secara Fisik
Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
3.1 Pemanasan
Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat :
jarum inokulum, pinset, batang L dan lain-lain. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-
kira 160-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alatyang terbuat dari kaca misalnya
erlenmeyer, tabung reaksi dan lain-lain.Uap air panas: konsep ini mirip dengan
mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya
tidak terjadi dehidrasi.Uap air panas bertekanan: menggunakan autoclave.
3.2 Penyinaran dengan UV
 Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan
disinari lampu UV
4. Sterilisaisi Secara Kimiawi
Biasanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan senyawa desinfektan antara lain
alkohol. Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya
alkohol.Umumnya isopropil alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan
antiseptik yang sangat efisien dan efektif. Penambahan yodium pada alkohol akan
meningkatkan daya disinfeksinya. Dengan menggunakan iodium, isopropil tidak efektif
terhadap spora.Solusi terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan
alkohol, tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik.
Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan dari tujuan tertentu serta efek
yang dikehendaki.Perlu juga diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iritatif dan
kepekaan kulit sangat bervariasi. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain
yaitu halogen (senyawa klorin, iodium), alkohol, fenol, hidrogen feroksida, zat warna ungu
kristal, derivat akridin, rosanalin, detergen, logam berat (hg, Ag, As, Zn), aldehida dan lain-
lain.
Sterilisasi panas memanfaatkan sumber panas untuk membunuh mikroba.Faktor dari
sterilisasi panas adalah temperatur sumber panas dan durasi pemanasan.Sumber panasnya
dapat dibagi menjadi 2 kategori yaitu panas lembab dan panas kering.
5. STERILISASI PANAS
Prinsip kerja:
1. Bunsen,Bunsen menggunakan metanol atau bahan bakar gas sebagai bahan
bakarnyaDigunakan untuk memanaskan dan/atau mensterilkan cairan dalam beaker, labu
erlenmeyer, dll dan juga untuk mensterilkan alat – alat laboratorium berbasis platina seperti
jarum inokulasi.
2. Oven,Oven merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan Uap Panas Kering.Protein
mikroba akan mengalami dehidrasi hingga terjadi kekeringan, selanjutnya teroksidasi oleh
oksigen di udara sehingga menyebabkan matinya mikroba
 3. Autoclave,Autoklaf merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan 2
atm/ 15 psi (pounds per square inci) dan suhu 121°C selama 15 menit untuk bahan dan 20
menit untuk alat.
4. BSC merupakan alat untuk mensterilisasi alat dan bahan dengan menggunakan teknik
pengaturan udara dan adanya penyinaran UV. sistem kerja ini sangat erat hubungannya
dengan kontaminasi mikroorganisme. Alat Ini juga penting dalam proses Pembuatan Media
Pertumbuhan Mikrobiologi agar tidak terjadi kontaminasi.
6. STERILISASI KIMIAWI
Sterilisasi kimiawi menggunakan Etilena Oksida (C2H4O)atau EtO. Etilena Oksida
adalah agen alkilasi, yangmenempelkan diri ke DNA mikroorganisme.Penempelan grupalkil
dalam DNA mikroorganisme mencegah mikroorganismebereproduksi. Gas EtO dapat menembus
paket dan mesintanpa menimbulkan kerusakan dan mensterilkan sehinggasering digunakan
dalam mensterilkan peralatan medis yangkecil dan peralatan elektronik medis.
Ruang EtO adalah ruang pensterilan menggunakan gas Etilena Oksida yang dicampur
dengan gas Nitrogen atau CO2 karena gas EtO murni memiliki titk didih 10,73 celsius dan
mudah meledak. Langkah – langkah pensterilannya ada pra-kondisi, sterilisasi, dan degassing.
7. STERILISASI FILTRASI
Sterilisasi filtrasi adalah teknik sterilisasidengan menggunakan filtrat untuk
menyaringlarutan dan memisahkannya dari patogensehingga larutan menjadi steril
tanpamenggunakan panas atau bahan kimia.Sterilisasi filtrasi tidak dapat mensterilkandengan
sempurna karena tidak dapatmenyaring virus karena terlalu kecil untukfiltratnya dan bahan kimia
yang telah terlarutdalam larutan.
Penyaringan membran,Dengan menggunakan membran yang terbuat dari selulosa
dengan lubang-lubang berukuran 0.45 µm atau lebih kecil dapat memisahkan larutan dari
mikroorganisme yang ada dalam larutan.
B. Alat-alat yang Digunakan dalam Kultur Jaringan
Widarto (2000) mengatakan bahwa banyak peralatan yang digunakan dalam sistemkultur
jaringan, tetapi pada dasarnya dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu:
1. Peralatan ringan, meliputi pinset, pisau, gelas ukur, gelas piala, erlenmeyer, botol media,
petridish, pipet, gunting, corong, panic, kompor gas, dll.
2. Peralatan berat, meliputi mesin penggojok, LAF (Laminar Air Flow), timbangan listrik atau
analitik, mesin destilator, oven, mikroskop, PH meter, pendingin ruangan, autoclave dan
entkas.
Berikut gambar dan prinsip kerja beberapa alat yang digunakan dalam metode kultur jaringan:

Tabel 1. Gambar dan prinsip kerja alat yang digunakan dalam metode kultur jaringan

No Nama Alat Gambar Prinsip Kerja

1. Gelas Ukur Menuangkan larutan atau zat kimia
secara dengan hati-hati.

2. Pipet Menekan bagian karet dari pipet ini

kemudian bagian ujungnya
dimasukkan ke dalam larutan dan
melepaskan karet tersebut.

3. Inkubator Memasukkan atau menyimpan biakan

murni mikroorganisme, kemudian
mengatur suhunya, biasanya hanya
dapat diatur diatas suhu tertentu

4. Mikroskop Cahaya Memantulkan cahaya melalui cermin,

lalu diteruskan hingga lensa objektif.

5. Vorteks Meletakkan tabung reaksi diatas

wadah penyimpanan lalu
dihomogenkan.
6. Kulkas Memasukkan medium secara
langsung kedalamnya, kemudian
mengatur suhunya sesuai dengan
ketentuan.

7. Sentrifuge Memutar tabung reaksi, dimana

ukuran tabung reaksi yang digunakan
harus sama.

8. Shaker Meletakkan tabung erlenmeyer diatas

wadah shaker, kemudian menyalakan
shaker untuk mengocok larutan yang
ada didalam tabung erlenmeyer.

9. Labu Erlenmeyer Menuangkan larutan atau zat kimia

secara langsung atau dengan
menggunakan corong dengan hati-
hati.

10. Corong Larutan langsung dituangkan kedalam

mulut corong, dimana sebelumnya
ujung corong telah dimasukkan ke
dalam mulut tabung.
11. Laminar Air Flow Mengalirkan arus udara yang laminar
ke dalam almari penabur melalui
saringan yang besar dengan ukuran
mesh 0,22-0,24 mikron.

12. Autoclave Alat sterilisasi dengan menggunakan

uap panas bertekanan 2 atm/ 15 psi
(pounds per square inci) dan suhu
121⁰C selama 15 menit untuk bahan
dan 20 menit untuk alat.
13. Oven Alat sterilisasi dengan menggunakan
uap panas kering.
Protein mikroba akan mengalami
dehidrasi hingga terjadi kekeringan,
selanjutnya teroksidasi oleh oksigen di
udara sehingga menyebabkan matinya
mikroba.

14. Bunsen Menggunakan metanol atau bahan

bakar gas sebagai bahan bakarnya.
Digunakan untuk memanaskan atau
mensterilkan cairan dalam beaker,
labu erlenmeyer dan juga untuk
mensterilkan alat-alat laboratorium
berbasis platina seperti jarum
inokulasi.
Daftar Pustaka
Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan.IPB Press.
Endang G. Lestari. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanaman melalui
Kultur Jaringan. Jurnal Biogen 7 (1):63-68
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation:
Principle And Practices. Sixth Ed.
Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants.Martinus Nijhoff
Publishers.Dordrecht.The Netherlands.

KELOMPOK 6

1. Arni Isma Nurrohmi (1500017019)

2. Intan Adelia Yuli R (1500017029)
3. Ria dwi novita (1500017038)
4. Arib Cahyo Saputra (1500017046)
5. Muhammad Ilham H. (1500017055)
6. Merlina (1500017098)\
7. Yuni Rohmawati (1500017063)
8. Kurnia Ismi Andini
9. Annisa Nur Azizah (1500017109)
10. Nada Nabillah S. (1515017090)