BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman adalah makhluk hidup yang berperan sebagai produsen di dalam ekosistem.
Tanaman dapat berkembang biak secara generative maupun vegetative. Secara generative
artinya tanaman berkembang melalui penyatuan benang sari dan putik atau polinasi. Tanaman
yang berkembang biak secara vegetative artinya tanaman tersebut memperbanyak diri tanpa
melalui pertemuan gamet jantan dan betina. Perkembangan vegetative akan menghasilkan
anakan yang memiliki sifat sama dengan dengan induknya
Berkurangnya pasokan sandang, pangan, dan papan dan kurangnya ketersediaan air
merupakan masalah utama bagi kelangsungan hidup umat manusia. Oleh sebab itu, diperlukan
suatu gerakan baru atau inovasi – inovasi baru dalam menghadapi masalah kekurangan
tersebut. Kegiatan seperti reboisasi merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan. Selain itu,
pembuatan tanaman transgenik adalah suatu inovasi baru yang dapat mengatasi masalah
kepunahan atau kekurangan pangan.
Kultur Jaringan merupakan suatu teknik perbanyakan tanaman dengan menggunakan
bagian tanaman yang berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro.
Praktek kultur jaringan tanaman bermula dari pembuktian sifat totipotensi (total genetic
potential) sel, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik
dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh,
jika kondisinya sesuai.
Perbanyakan secara kultur jaringan dapat menghasilkan tanaman tanaman dalam jumlah
yang sangat banyak dan membutuhkan waktu yang relative singkat. Perbanyakan dengan kultur
jaringan tidak dapat dilakukan secara langsung melainkan harus menggunakan ala tang lengkap
dan steril di dalam laboratorium. Kebersihan alat akan mempengaruhi perkembangan suatu
tanaman sehingga dibutuhkan alat-alat yang steril dan ruangan yang steril dan pengerjaan yang
hati-hati untuk mendapatkan hasil yang baik.
Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu penanaman
eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu
kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah
benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di

1
 Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau
dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).

Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan eksplan juga
dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat dilakukan pada ruangan tertutup atau
ruangan penabur dalam Laminair Air Flow (LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan
sterilisasi dengan menggunakan larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan
membiarkan ruangan selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala.

Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup
mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan
perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi
terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga
harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun
terkena serangan mikroba.

Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan fenomena yang cukup
mengganggu dalam proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan
perlakuan- perlakuan yang aseptic. Oleh karena sangat penting mempelajari dan
mempraktekkan langsung bagaimana teknik aseptic tersebut untuk mencegah adanya
kontaminasi pada kultur jaringan.
Teknik sterilisasi dalam kultur jaringan adalah suatu proses perlakuan terhadap bahan
eksplan atau barang dimana pada akhir proses tidak terdapat mikroorganisme pada bahan atau
barang tersebut(Diana 2004).

1.2 Tujuan
1. Mengetahui metode sterilisasi eksplan
2. Mengenal bahan yang dibutuhkan dalam sterilisasi eksplan

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Dasar Teori

Aseptik adalah suatu keadaan terbebas dari organisme yang tidak diinginkan yang dapat
mengganggu pertumbuhan organisme utama. Keadaan terbebas ini mulai dari peralatan, media,
bahan tanam dan lingkungan kerja. Ada beberapa persyaratan utama dalam laboratorium dan
semua fasilitas dan sarana yang ada didalamnya agar tetap salam kondisi aseptik (steril).
Salah satu kunci keberhasilan dalam melakukan penanaman secara in vitro adalah
sterilisasi bahan tanam (eksplan). Eksplan yang akan ditanam pada media harus bebas dari
mikroorganisme yang menyebabkan kontaminan. Tahapan sterilisasi menjadi salah satu
kendala utama keberhasilan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro. Indonesia juga
mempunyai iklim tropis yang memungkinkan kontaminan seperti cendawan dan bakteri terus
tumbuha sepanjang tahun. Untuk jenis tanaman tertentu, sterilisasi susah dilakukan karena
kontaminan berada pada bagian internal dari jaringan tumbuhan tersebut.
Sterilisasi merupakan proses pembebasan bagian permukaan atau medium dari semua
mikroorganisme baik dalam fase vegetatif atau spora (Priyadarshini, 2011). Proses aseptik
memainkan peran penting dalam memberikan formulasi steril yang tidak dapat disterilisasi.
Namun, sterilisasi terminal, dikhususkan menggunakan proses panas lembab, karena dianggap
metode pilihan dalam mensterilkan (Gupta,2010 ). Sterilisasi alat-alat laboratorium dari gelas
misalnya: petri, tabung gelas, botol, pipet, dll, juga untuk bahan-bahan minyak dan powder
misalnya talk menggunakan sterilisasi dengan udara panas (hot air oven) (Putranto, 2014).
Sterilisasi eksplan dapat dilakukan dengan cara merendam bahan tanam dalam larutan
kimia sistemik dengan waktu dan konsentrasi perendaman tertentu. sterilisasi dengna cara ini
dapat dilakukan dengan menggunakan satu macam atau beberapa macam bahan kimia. Pada
umumnya bahan kimia yang sering digunakan untuk sterilisasi adlah alkohol, natrium
hipoklorit (NaOCl), kalsium hipoklorit atau kaporit (CaOCl), sublimat (HgCl2), dan hidrogen
peroksida (H2O2).
Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tahan terhadap panas dan untuk
sterilisasi aquades dengan suhu 1210C selama 30 menit sedangkan untuk alat yang tidak tahan
terhadap panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. Begitu juga dengan media yang
akan digunakan juga harus disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan autoclave pada
suhu 1210C selama 15 menit (Fitri, 2012). Hal yang harus diperhatikan bila mengerjakan

3
sterilisasi menggunakan autoclave adalah: harus ditunggu selama bekerja, hati-hati bila
mengurangi tekanan dalam autoclave (perubahan temperatur dan tekanan secara mendadak
dapat menyebabkan cairan yang disterilkan meletus dan gelas-gelas dapat pecah) (Putranto,
2014).
Laminar Air Flow (LAF) dan alat yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu
dengan cara disemprot dengan alkohol 70%. Sebelum melakukan percobaan, alat yang akan
digunakan diletakkan di dalam LAF, kemudian menyalakan Fan dan Lampu UV pada LAF
selama 30 menit (Sitorus, 2011). Ketika lampu UV dinyalakan, pintu laminar air flowharus
ditutup. Sementara itu, alat yang akan digunakan disterilisasi dengan cara menyemprotkan
alkohol. Prinsip kerja laminar air flow adalah setiap peralatan yang masuk ke dalam harus
steril. Dengan demikian, peralatan dan bahan yang diperlukan harus disemprot dengan alkohol
70% termasuk tangan kita (Sandra, 2004).
Dalam melakukan sterilisasi, kita harus mengetahui metode sterilisasi bahan tanam
yang benar karena steril atau tidaknya bahan tanam akan mempengaruhi keberhasilan
pertumbuhan eksplan tersebut. beberapa penelitian menunjukkan bahwa dapat terbentuk suatu
kalus dari bahan tanam yang tumbuh jika melakukan teknik kultur jaringan dalam kondisi
aseptik dengan sterilisasi guna mengurangi kontaminasi mikroorganisme (Darini, 2012).
Sebelum dilakukan sterilisasi, pada tahap persiapan alat-alat yang akan digunakan
semua peralatan dicuci bersih dengan menggunakan detergen dan larutan pemutih sampai
bersih, dan membilasnya sampai bersih. Setelah dibersihkan kemudian alat-alat disterilisasi
menggunakan oven atau autoclave. Bahan-bahan yang dapat disterilkan dengan
menggunakan autoclave antara lain tutp botol plastik, peralatan gelas, peralatan diseksi, pipet,
air murni, dan media kultur. Semua peralatan diseksi yang akan di sterilkan dibungkus dengan
kertas atau aluminium foil. Setelah itu mengatur autoclave dengan suhu 1210C dengan tekanan
15 psi selama 15-20 menit. Untuk peralatan yang tebuat dari logam, wadah-wadah, gelas,
aluminium foil dan lainnya dapat disterilisasi dengan cara pemanasan dalam oven pada suhu
130-1700C selama 2-4 jam (Tuhuteru, 2012).
Dalam mensterilkan eksplan, biasanya digunakan clorox 10% dan alkohol 70%.
Sterilisasi eksplan dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu eksplan dibersihkan dengan air
mengalir sebanyak 2-3 kali, kemudian mencuci dengan detergen dan membilas dengan
aquadest pada akhir pencuciannya. Eksplan direndam kedalam ethanol 70% selama beberapa
menit. Kemudian dicuci dengan air sebanyak 2-3 kali dan direndam dengan 0,1% bavistin
selama 15 menit. Selanjutnya dicuci dengan aquades sebanyak 2-3 kali. Lalu direndam

4
kedalam HgCl2selama beberapa menit dan kemudian dicuci lagi dengan menggunakan aquades
(Lalitha, 2014).
Cara lain yang dapat dilakukan untuk mensterilkan eksplan yang masih terbungkus
dalam pelepahnya seperti jantung pisang yaitu dengan cara segera mencuci dengan
menggunakan detergen dan membilasnya dengan menggunakan air yang mengalir.
Selanjutnya, di dalam Laminar Air Flow cabinet, pelepah dibuang, lalu disemprot dengan
alkohol 96% dan membakar pada bunsen. Setelah api padam, selanjutnya pelepah dibuka
kembali, eksplan diambil secara hati-hati dengan melepaskan pelepah yang masih menepel satu
demi satu dan kemudian ditanamkan pada botol kultur secara aseptik (Lalitha, 2014). Eksplan
yang sudah di sterilkan kemudian akan di tanam kedalam media. Eksplan yang sudah ditanam
akan diinkubasi dengan temperatur 28±20C dengan pengaturan cahaya yaitu 16 jam terang dan
8 jam gelap dengan intensitas cahaya 2000 lux (Ogero, 2012).
Tujuan utama dilakukan sterilisasi eksplan sebelum ditanam kedalam media adalah
untuk menhilangkan mikroorganisme yang ada pada eksplan yang nanti akan menyebabkan
terjadinya kontaminasi. Kontaminasi tersebut berpengaruh terhadap pertumbuhan eksplan,
dimana eksplan akan mengalami hambatan dalam perkembangannya. Bahan kimia yang
biasanya digunakan untuk sterilisasi media kultur jaringan adalah HgCl2dan NaClO. Dalam
mengatasi terjadinya kontaminasi biasanya digunakan antibiotik karena lebih efektif terhadap
beberapa bakteri yang mengganggu pertumbuhan eksplan. Selain antibiotik, juga digunakan
bahan kimia lain seperti clorox (NaOCl) yang merupakan pensteril permukaan jaringan
tanaman.
Sterilisasi eksplan terdiri atas dua metode atau cara yaitu secara mekanik dan kimia.
a. Sterilisasi eksplan secara mekanis
Sterilisasi eksplan secara mekanis digunakan untuk eksplan yang keras atau
berdaging yaitu dengan membakar eksplan diatas lampu spiritus sebanyak tiga kal.
Eksplan keras yang disterilisasi dengan cara ini yaitu tebu, biji salak, buanga buah
anggrek, kapulaga. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain wortel, umbi,
bawang putih.
b. Sterilisasi eksplan secara kimiawi
Stelirisasi eksplan secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak ( jaringan
muda ) seperti daun, tangkai daun, anther. Bahan-bahan kimia yang dapat digunakan
untuk sterilisasi antara lain :
- Sodium hipokhlorit

5
 Nama dagangannya adalah Clorox dan bayclin. Kosentrasi untuk steril tergantung
dari kelunakan eksplan, dapat 5%-10%, dan waktunya antara 5-10 menit.
Pembentukan larutan Clorox adalah dengan menuangkan Clorox dan aquades
dengan perbandingan 1:4 (misalkan 25 ml Clorox dan 100 ml aquades steril),
kemudian ditambah dengan tween-20sebanyak satu tetes dan dicampur.
Cara sterilisasi di dalam laminar air flow adalah sebagai berikut : pertama-tama
eksplan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi larutan Clorox tadi.
Kemudian leher Erlenmeyer dipegang dan digoyang-goyang dengan arah
memutar mendatar selama kurang lebih 3 menit. Langkah selanjutnya adalah
mencuci bersih eksplan tersebut dengan aquades steril sebanyak 3-5 kali, masing-
masing selama 3 menit. Setelah selesai eksplan diambil bagian dengan pinset dan
diletakkan diatas petridish yang ada kertas saringnya, dengan demikian eksplan
sudah siap untuk ditanam.
- Mercuri khorit
Nama dagannya adalah sublimat 0,05%. Penggunaan bahan kimia ini harus
berhati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan sublimat sama
dengan sterilisasi dengan Clorox, hanya waktunya lebih pendek karena sublimat
bersifat keras. Bila sterilisasi terlalu lama dapat memnyebabkan kerusakan pada
eksplan (berwarna coklat) sehingga eksplan tersebut tidak akan mampu tumbuh
menjadi kalus.
- Alcohol 70%
Alcohol lebih banyak dipertahankan dalam bentuk alcohol 95%. Jamur biasannya
mati dengan alcohol 70%, sedangkan dengan alcohol 95% masih tetap hidup. Oleh
karena itu alcohol 95% perlu diencerkan menjadi alcohol 70%. Caranya adalah
sebagai berikut tuangkan alcohol 95%, sebanyak 25 ml ke dalam gelas ukur,
kemudian tambahkan aquades sebanyak 70 ml, sehingga volume akhir menjadi 95
ml.

6
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 ALAT
- Cawan petri steril
- Pinset steril
- Beker glas steril
- Erlenmeyer steril
- Skapel steril
- Gelas ukur
- Pengaduk
- Laminar air flow
- Api spiritus

3.2 BAHAN
- Daun anggur
- Daun lokat
- Daun pucuk merah
- Daun kamboja
- Daun mangga

3.3 CARA KERJA

3.3.1 Persiapan ruang penabur

1. Sebelum digunakan ruang penabur disterilkan dengan sinar UV selama 30 menit

atau dengan menyemprotkan alkohol 96% ke bagian tangan dan botol yang
berisi media
2. Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel dan pinset
serta alcohol 96% yang digunakan untuk mensterilkan dissecting kit (scalpel
dan pinset) disebelah kiri Bunsen sedangkan botol kultur disebelah kanan.
3. Petridish diletakan dibagian tengah, setiap selesai eksplant dipotong petridish
ditutup kembali untuk menghindari kontaminasi.
4. Selesai digunakan alat disterilkan dengan alkohok dan dibakar dengan Bunsen.

7
 5. Sebelum masuk kedalam LAF semua seperti botol dan tangan harus disterilkan
dengan alcohol 96%.
6. Setiap selesai menggunakan pinset maupun scalpel, lalu dicelupkan kedalam
alkohol, lalu dibakar pada nyala api bunsen.

3.3.2 Penyiapan Eksplan

Eksplan adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun, tunas,
pucuk, bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplas dan yang lainnya.

3.2.3 Penanaman Eksplan

a. Disiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk penanaman eksplan.

b. Diambil potongan eksplan yang sudah siap untuk ditanam dengan pinset.
c. Dibuka botol kultur yang telah berisi media dan dibakar bagian mulut botol.
d. Diletakan eksplan kedalam media dengan hati-hati.
e. Botol ditutup dengan kertas aluminium foil dan diseal.
f. Diletakan pada ruang inkubasi.
g. Diamati perkembangan eksplan.

8
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Data Pengamatan

No Gambar Keterangan
1. Proses penanaman eksplan pada
daun delima yang di celupkan ke
alcohol dengan menggunakan
pinset.

2. Penanaman daun mangga pada

media MS

9
 3. Penanaman eksplan daun mangga
pada media MS beberapa
mengalami browning (kecoklatan)
dan beberapa ada yang masih
hidup tetapi tidak mengalami
pertumbuhan

4.2 Pembahasan

Menurut Srilestari 2005 faktor-faktor yang mempengaruhi teknik kultur jaringan yaitu
vitamin yang mempengaruhi keberhasilan secara in vitro dan cara modifikasi sukrosa pada
media karena sukrosa dalam media berfungsi sebagai sumber energi dan untuk keseimbangan
tekanan osmotik media. Selain itu, faktor yang mempengaruhi teknik kultur jaringan yaitu
bahan tanaman atau eksplan yang digunakan untuk perbanyakan. Hal yang harus diperhatikan
dalam eksplan yaitu umur eksplan,genotipe/varietas, letak pada cabang, dan seks
(jantan/betina) (Srilestari 2005). Faktor yang lain yaitu keadaan lingkungan. Lingkungan
tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi pH, temperatur, panjang
penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur (Sriyanti 2000).

Kultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu tanaman dengan cara
menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam keadaan steril. Dalam
melakukan proses kultur jaringan ada beberapa langkah yang harus dilakukan diantaranya
adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai hal ini penting karena menyangkut materi yang
akan digunakan. Setelah mengetahui tujuan yang aingin dicapai langkah yang dilakukan
berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan.( Nasir,2001)

Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di temapt yang sembarangan, akan tetapi
dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses penyimpanan eksplan dilakukan di dalam
ruang penabur. Dimana ruang penabur merupakan kunci keberhasilan budidaya in-vitro.

10
Didalam ruangan ini semua dilakukan dengan steril, dan pengawasan kesterilan di ruang
penabur tersebut sangat ketat.( Moeso S,1996 )

LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman eksplan ( bahan
tanam ). Di dalam laminar, terdapat blower dan lampu ultra violet. Blower menghembuskan
udara halus melalui suatu kotak filter yang fungsi untuk mencegah kontaminan yang berasal
dari udara. Sementara itu, lampu ultra violet berfungsi untuk mematikan kontaminan yang
berada di permukaan dalam laminar, permukaan dalam laminar dilap dengan kapas atau tissu
yang sebelumnya dicelupkan dalam alkohol 70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama
0,5-1jam (Hendaryono,1994 ).

Pada saat di biarkan selama satu minggu terdapat perubahan warna menjadi kecoklatan
dan tidak bisa mengalami pertumbuhan. Dalam hal ini dapat disebabkan karena kurangnya
kandungan nutrisi pada media MS yang digunakan sebagai media tanam. Serta kurangnya
seterilil dalam melakukan tahap tahap setrilisasi dapan menjadikan eksplan terkontaminasi oleh
bakteri dan menjadi sulit tumbuh

11
 BAB V

PENUTUP

KESIMPULAN

Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat

sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara mencelupkan
scalpel dan pinset ke dalam alcohol 70% lalu dibakar pada nyala api Bunsen. Setelah itu alat
baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap botol kultur, diisi 1 potong eksplan.

Pada proses penanaman, tahap pertama adalah persiapan bahan dan sterilisasi alat
beserta ruangan. Selain itu juga diperlukan ketelitian yang tinggi untuk menjaga agar tidak
terjadi kekeliruan atau kesalahan.

Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses penanaman yaitu sterilnya alat dan
bahan yang digunakan, sistematika penggunaan lab, dan teknik yang digunakan dalam proses
penanaman.

12
 DAFTAR PUSTAKA

Wetherel, D.F. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Avery Publishing Group Inc. New
Jersey. Jakarta

Hendaryono DPS, Wijayani A. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.
Thompson S. 2003. Formulasi Steril . Yogyakarta: Andi Pradhika.
Diana arisanti .2004.Efektivitas Sterilisasi Menggunakan Sinar Ultraviolet terhadap Penurunan
Angka Kuman Udara di Ruang Operasi IBS RSUD Tugurejo semarang. [skiripsi] Fakultas
Kesehatan Masyarakat, Universitas Diponogoro.
Andini,Linda. 2001. Cara memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Jakarta: Agromedia
Pustaka.
Indrianto, Yuni.2002. Pembiakan Tanaman Melalui Kultur Jaringan. Jakarta: Gramedia.

13