I.

STERILISASI ALAT DAN PEMBUATAN LARUTAN STOK

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan teknik mengembangbiakan
bagian tanaman, baik berupa bagian terkecil seperti sel sampai jaringan
tanaman maupun organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Upaya
perbanyakan tanaman melalui teknik kultur in vitro diperlukan adanya
kecocokan medium tanam dan penggunaan zat pengatur tumbuh (ZPT),
baik jenis maupun konsentrasi ZPT. Kecocokan tersebut diperlukan untuk
mencapai keberhasilan baik dalam upaya pembentukan tunas maupun
pembentukan akar pada eksplan yang ditanam.
Hal yang paling utama untuk dilakukan dalam kultur jaringan
adalah sterilisasi alat. Sterilisasi merupakan cara pencegahan yang
dilakukan manusia untuk membasmi mikroorganisme, terutama pada
berbagai macam alat – alat gelas. Sterilisasi dilakukan dengan melihat
bahan dari alat-alat tersebut sehingga dapat menentukan cara sterilisasi
yang tepat. Teknik in vitro mudah sekali terjadi kontaminasi dari
lingkungan sekitar sehingga sterilisasi sangat perlu dilakukan, agar hasil
yang akan diperoleh sesuai dengan apa yang diinginkan. Sterilisasi dapat
dilakukan dengan pemanasan, penggunaan bahan kimia, penggunaan
penyaring atau filter tergantung dari bahan yang akan disterilkan.
Penggunaan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan
yang berulang–ulang setiap kali membuat. Larutan stok merupakan
larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya
lebih tinggi daripada konsentrasi kompenen tersebut dalam formulasi
media yang akan dibuat. Larutan stok biasanya dibuat dengan konsentrasi
10, 100 atau 1000 kali lebih pekat. Jika larutan stok dibuat, pembuatan
media dapat dilakukan dengan cara mengambil sejumlah larutan stik
sehingga konsentrasinya menjadi sesuai dengan yang terdapat pada
formulasi media yang dikehendaki (Yusnita 2003).
2. Tujuan Praktikum
 a. Mengetahui metode dan macam sterilisasi dalam kultur jaringan yang
meliputi sterilisasi alat, ruang, dan eksplan
b. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman (diseksi) dan alat
kaca seperti botol kultur, petridish, erlenmeyer, dan lain-lain
c. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
terutama dalam pembuatan stok makro nutrien, mikro nutrien, larutan
buffer (Fe-EDTA), vitamin, dan zat pengatur tumbuh (ZPT)
B. Tinjauan Pustaka
Perbanyakan tanaman hingga saat ini dilakukan melalui perbanyakan
vegetatif membutuhkan waktu lebih lama untuk memproduksi tanaman dalam
jumlah banyak. Salah satu solusi dari permasalahan tersebut adalah
perbanyakan tanaman dengan menggunakan metode kultur jaringan (in vitro)
yang dapat dilakukan secara langsung dari organ tanaman ataupun melalui
fase kalus. Salah satu indikator adanya pertumbuhan dalam kultur in vitro
adalah munculnya kalus pada eksplan (Sitinjak et al. 2015).
Teknik kultur jaringan merupakan teknik yang efisien untuk
perbanyakan klonal tanaman. Teknik kultur jaringan juga memberi peluang
untuk terbentuknya individu dengan karakter unggul melalui induksi variasi
somaklonal atau teknik rekayasa genetika. Teknik kultur jaringan memiliki
keunggulan daripada perbanyakan pada umumnya. Metode perbanyakan
vegetatif seringkali memiliki kelemahan yaitu adanya patogen virus yang
dibawa dari induk, akumulasi patogen dari induk akan diturunkan pada setiap
generasi sehingga dapat mengakibatkan menurunnya produktivitas tanaman
(Kurniawan dan Wahyu 2016).
Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman,
seperti protoplasma, sel, kelompok sel, jaringan, dan organ serta
menumbuhkan dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan bersegregasi menjadi tanaman lengkap kembali.
Bagian tanaman yang digunakan untuk kultur jaringan biasanya adalah
jaringan yang masih muda. Jaringan tersebut berasal dari organ vegetatif
seperti akar, batang, dan daun maupun organ generatif seperti embrio, biji,
anther, atau ovul serta bagia lain dari bunga. Keberhasilan kultur in vitro
ditentukan oleh media, zat pengatur tumbuh dan macam tanaman
(Elimasni et al. 2006).
Sterilisasi eksplan untuk mendapatkan eksplan aseptik dibutuhkan
kegiatan karantina semai sebelum disterilisasi untuk mendapatkan eksplan
yang sehat. Eksplan yang digunakan pada teknik mikropropagasi harus bebas
dari kontaminan, seperti fungi dan bakteri. Teknik sterilisasi permukaan
banyak digunakan untuk menghilangkan kontaminan yang terdapat pada
permukaan eksplan. Selama proses sterilisasi, eksplan harus tetap hidup dan
hanya kontaminan yang dieliminasi. Sterilisasi permukaan dilakukan dengan
merendam eksplan dalam larutan disinfektan dengan konsentrasi tertentu
selama periode tertentu (Ardiasnyah et al. 2014).
Kegiatan sterilisasi merupakan upaya yang dilakukan dalam rangka
mencegah dan menghindari kontaminasi. Kegiatan ini mutlak yang harus
dilakukan dalam berbagai rangkaian kegiatan kultur in vitro. Sterilisasi sangat
menentukan keberhasilan dalam perbanyakan tanaman melalui teknik ini.
Kegiatan sterilisasi eksplan yang dilakukan bertujuan untuk menghilangkan
mikroorganisme yang kemungkinan terbawa saat pengambilan eksplan dan
ini berpotensi untuk terjadinya kontaminasi pada tahapan selanjutnya dan
berdampak pada penghambatan pertumbuhan eksplan menjadi kalus ataupun
tanaman utuh didalam media in vitro (Shofiyani dan Neni 2015).
Hal penting yang perlu disadari dalam sterilisasi bahan tanam adalah
bahwa sel tanaman dan kontaminan merupakan benda hidup, sehingga
kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Di negara-
negara tropis, kontaminasi permukaan ini merupakan masalah serius,
sehingga beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan. Perbanyakan tanaman
secara in vitro bertujuan untuk memperoleh bahan tanaman steril yang akan
digunakan untuk perbanyakan bibit. Proses sterilisasi yang tepat untuk
mematikan mikroorganisme yang terdapat pada eksplan sehingga tidak
mengganggu pertumbuhan tanaman. Keberhasilan sterilisasi dipengaruhi oleh
sumber eksplan (tanaman), seperti tanaman herbal atau berkayu, dan kondisi
lingkungan (Aisyah dan Dedi 2011).
 Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam
membuat media. Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi media MS
yang diaduk dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat. Setelah
membuat larutan stok gram-gram, perlu dibuat stok zat pengatur tumbuh
biasanya dalam 100 ml. Stok harus disimpan di dalam lemari es
(Harahap et al. 2013)
Larutan stok zat pengatur tumbuh (ZPT) yang sering digunakan untuk
menginduksi pembentukan kalus adalah auksin. Diatara golongan auksin
yang umum digunakan pada media kultur jaringan adalah 2,4-D dan IAA.
Dibanding dengan golongan auksin IAA, 2,4-D memiliki sifat lebih stabil
karena tidak mudah terurai oleh enzim-enzim yang dikeluarkan oleh sel
tanaman ataupun oleh pemanasan pada proses sterilisasi. Pembuatan larutan
stok 2,4-D 100 ppm dilakukan dengan penimbangan bahan sebanyak 10 mg
lalu ditambahkan 50 ml aquades steril ke dalam erlenmeyer 100 ml. Sambil
diaduk, diteteskan larutan KOH 1 N sampai larut. Larutan ditambahkan
aquades hingga volumenya mencapai 100 ml (Indah dan Dini 2013).
Salah satu jenis ZPT dari golongan sitokinin yang sering dipakai dalam
kultur jaringan adalah BAP (6-benzylaminopurine). 6-Benzilaminopurine
(BAP) merupakan salah satu sitokinin sintetik yang aktif dan daya
merangsangnya lebih lama karena tidak mudah dirombak oleh enzim dalam
tanaman. BAP memiliki struktur yang mirip dengan kinetin dan juga aktif
dalam pertumbuhan dan proliferasi kalus. BAP merupakan sitokinin yang
paling aktif (Nursetiadi et al. 2016)

C. Metodologi Praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Acara 1 tentang Sterilisasi Alat dan Pembuatan Larutan
Stok dilaksanakan pada hari Senin, 1 Oktober 2018 pukul 13.00 sampai
selesai bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian
UNS
2. Alat dan Bahan
a. Alat
1) Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) lengkap dengan lampu bunsen
yang berisi spiritus
2) Petridish dan botol-botol kultur
3) Peralatan diseksi, yaitu pinset besar/kecil, pisau pemes, gunting
eksplan
4) Alat-alat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi
dibungkus dengan kertas, kemudian disterilisasi di dalam autoklaf
pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit.
b. Bahan
1) Larutan stok, terdiri atas unsur makro, mikro, vitamin, buffer, dan
ZPT
2) Aquadest
3) NaOH 1 N dan HCl 1 N
3. Cara Kerja
a. Sterilisisasi Alat
1) Meletakkan semua alat kerja yang akan digunakan dalam
penanaman kultur jaringan
2) Meletakkan bunsen di tengah-tengah alat dan menghidupkan
bunsen dengan api dan membiarkan sebentar
3) Memanaskan alat-alat kerja seperti pisau, pinset dan lainnya
dengan meletakkan dekat dengan air bunsen sampai sedikit
terbakar kemudian meletakkan di tempat yang steril

b. Pembuatan Larutan Stok

1) Larutan stok media
a) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan menjadi
beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro
dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali
konsentrasi
b) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest
dengan volume tertentu, misalnya 500 ml
c) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refrigerator
2) Larutan stok zat pengatur tumbuh
a) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml
adalah sebagai berikut: 100 ppm = 100mg/l
b) Melarutkan bahan dengan alkohol atau NaOH 1 N kemudian
menambah aquadest sampai 300 ml untuk BAP
c) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol
dan menyimpannya ke dalam refrigerator
D. Pembahasan
Perbanyakan tanaman secara generatif masih memiliki kendala dalam
memperoleh biji tanaman. Perbanyakan tanaman secara kultur jaringan (in
vitro) merupakan salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut.
Diharapkan dengan metode kultur jaringan akan diperoleh bibit dalam jumlah
yang banyak, cepat, dan seragam. kultur jaringan akan berhasil dengan baik
apabila syarat-syarat yang dibutuhkan dapat terpenuhi. Syarat-syarat tersebut
meliputi, pemilihan eksplan/bahan tanam, penggunaan media yang cocok dan
keadaan yang aseptik.
Alat-alat yang diperlukan dalam menanam tanaman dengan teknik
kultur jaringan yaitu botol-botol kultur, tutup botol kultur, hot plate stirer,
magnetik stirer, pipet tetes, gelas ukur, erlenmeyer, pinset, pH meter, bunsen,
laminar air flow cabinet (LAFC), autoklaf, timbangan analitik. Botol kultur
berfungsi sebagai tempat atau wadah bagi eksplan tumbuh. Botol kultur
tersebut ditutup dengan tutup botol kultur agar eksplan tidak terkontaminasi
dengan lingkungan luar. Hot plate stirer dan magnetik stirer berfungsi
memanaskan dan menghomogenkan larutan media yang akan digunakan.
Pipet tetes berfungsi untuk mengambil atau meletakkan larutan ke tempat
yang diinginkan. Gelas ukur berfungsi sebagai campuran pembuatan media
atau dapat digunakan mengukur larutan yang akan digunakan. Pinset
berfungsi mengambil atau menempatkan eksplan ke botol-botol kultur agar
eksplan tetap steril. pH meter berfungsi mengukur pH larutan media tanam
agar sesuai dengan kondisi eksplan tumbuh. Bunsen merupakan alat yang
digunakan untuk mensterilisasi alat-alat yang digunakan dalam kultur
jaringan. Autoklaf merupakan alat yang digunakan untuk mensterilisasi
menggunakan uap. Menurut Neuman et al. (2013) cara kerja autoklaf adalah
menguapkan alat yang disterilisasi sampai uap jenuh pada suhu yang lebih
tinggi sehingga menyebabkan denaturasi protein dan dapat mematikan agen
infeksi seperti bakteri, virus, atau spora virus. Laminar air flow cabinet
(LAFC) merupakan tempat melakukan inokulasi eksplan. Menurut Rashed et
al. (2016) LAFC ini memiliki sinar ultra violet yang berguna untuk
mengurangi kontaminasi dimana dihidupkan satu jam sebelum digunakan.
Eksplan dapat mengalami kontaminasi bakteri, jamur, atau virus.
Kontaminasi tersebut dapat masuk ke dalam media, alat yang tidak steril, dan
lingkungan kerja yang kotor, sehingga perlu diadakannya sterilisasi.
Sterilisasi merupakan upaya yang kita lakukan agar media atau bahan tanam
terhindar dari kontaminasi. Terdapat berbagai upaya sterilisasi, yaitu
sterilisasi diri dengan menggunakan alkohol 70%, sterilisasi pemanasan
menggunakan lampu bunsen yang digunakan untuk mensterilkan alat kerja.
Sterilisasi uap menggunakan autoklaf dan sterilisasi menggunakan oven.
Menurut Shofiya dan Neni (2015) Sterilisasi sangat menentukan keberhasilan
dalam perbanyakan tanaman melalui teknik ini. Kegiatan sterilisasi eksplan
yang dilakukan bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme yang
kemungkinan terbawa saat pengambilan eksplan dan ini berpotensi untuk
terjadinya kontaminasi pada tahapan selanjutnya dan berdampak pada
penghambatan pertumbuhan eksplan menjadi kalus ataupun tanaman utuh
didalam media in vitro.
Eksplan yang ditumbuhkan melalui kultur jaringan memerlukan media
tanam yang mengandung nutrisi yang diperlukan sebagai pengganti pupuk.
Media sebagai tempat tumbuh eksplan terbuat dari larutan stok. Larutan stok
terdiri dari unsur makro, mikro, vitamin, Fe-DTA, hormon yang berguna bagi
perkembangan eksplan. Menurut Harahap et al. (2013) pembuatan larutan
stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam membuat media. Larutan
stok hormon yang biasa digunakan adalah BAP. BAP merupakan zat pengatur
tumbuh dari golongan sitokinin yang berfungsi merangsang pertumbuhan
kalus. Larutan stok yang dibuat menjadi media tanam harus sesuai dengan pH
yang dibutuhkan tanaman untuk tumbuh. pH yang tidak sesuai akan
menyebabkan eksplan mengalami kematian atau mengalami gangguan
fisiologis.
E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan
bahwa:
a. Kultur jaringan merupakan teknik budidaya tanaman suatu metode
untuk mengisolasi bagian tanaman, seperti protoplasma, sel,
kelompok sel, jaringan, dan organ serta menumbuhkan dalam kondisi
aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri
dan bersegregasi menjadi tanaman lengkap kembali.
b. Prinsip dari teknik kultur jaringan ini adalah bahwa semua bagian
tanaman baik berupa sel, jaringan, dan organ tanaman, dapat menjadi
tanaman baru apabila ditumbuhkan dalam kondisi yang aseptik,
dengan cara steril.
c. Keberhasilan kultur jaringan ditentukan oleh media tanam yang
aseptik dan eksplan.
d. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan harus steril agar tidak
menyebabkan kontaminasi pada eksplan.
e. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan meliputi botol kultur,
autoklaf, laminar air flow cabinet, hot plate stirer dan magnetik stirer,
pipet tetes, erlenmeyer, gelas ukur.
f. Larutan stok merupakan larutan yang digunakan sebagai pembuatan
media tanam eksplan. Pembuatan larutan stok bertujuan memudah
pekerjaan.
g. Larutan stok terdiri dari unsur makro, mikro, vitamin, hormon, Fe-
DTA yang memiliki fungsi dalam perkembangan eksplan.
2. Saran
Praktikum sterilisasi alat dan pembuatan larutan stok sudah
berjalan baik, namun praktikan perlu memanajemen waktu agar
praktikum dapat selesai tepat waktu
 DAFTAR PUSTAKA

Aisyah S, Dedi S. 2011. Teknik Sterilisasi Rimpang Jahe Sebagai Bahan

Perbanyakan Tanaman Jahe Secara In Vitro. Buletin Teknik Pertanian 16(1):
34-36

Ardiansyah R, Supriyanto, Arum. 2014. Teknik sterilisasi eksplan dan induksi

tunas dalam mikropropagasi tembesu (Fagraea gragrans). J Silvikultur
Tropika 5(3): 167-173

Elimasni, Isnaini N, Zaidun. 2006. Inisiasi in vitro biji muda terong belanda
(Solanum betaceum) berastagi Sumatera Utara pada komposisi media dan
zat tumbuh yang berbeda. J Biologi Sumatera 1(1): 15-19

Harahap Erni R, Luthfi, Eva S. 2013. Pertumbuhan akar pada perkecambahan

beberapa varietas tomat dengan pemberian polyehylene glikol (PEG) secara
in vitro. J Agroekoteknologi 1(3): 419-428

Indah Putri N, Dini E. 2013. Induksi kalus daun nyamplung (Calophyllum

inophyllum L) pada beberapa kombinasi konsentrasi BAP dan 2,4-D. J Sains
dan Seni Pomits 2(1): 1-6

Kurniawan A, Wahyu W. 2016. Regenerasi in vitro tanaman bawang merah

(Allium ascalonicum). J Biotropika 4(1): 1-4

Neuman O, Curtis F, Albert. 2013. Compact solar autoclave based on steam

generation using broadband light-harvesting nanoparticles. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 110(2):
11677-11681

Nursetiadi E, Endang Y, Retna B. 2016. Pengaruh macam media dan konsentrasi

BAP terhadap multiplikasi tanaman manggis (Garcinia mangostana) secara
in vitro. J Bioteknologi 13(2): 63-72

Rashed M, Roy M, Paul S. 2016. In vitro screening of salt tolerent genotypes in

tomato (Solanum lycopersicum). J Hortic 3: 1-8

Shofiyani Anis, Neni D. 2015. Pengembangan metode sterilisasi pada berbagai

eksplan guna meningkatkan keberhasilan kultur kalus kencur (Kaemferia
galangal). J Agritech 12(1): 55-64

Sitinjak M, Mayta N, Siti F. 2015. Induksi kalus dari eksplan daun in vitro keladi
tikus (Typhonium sp.) dengan perlakuan 2,4-D dan kinetin. J Biologi 8(1):
32-39